单克隆抗体药物及其糖基化修饰的质谱分析方法研究

发布时间：2017-04-21 17:12

  本文关键词：单克隆抗体药物及其糖基化修饰的质谱分析方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的基于蛋白质组学的研究方法,对贝伐珠(Bevacizumab)单克隆抗体药物进行了肽谱和糖基化修饰形态的定性分析,建立测定贝伐珠单抗及其糖基化修饰的质谱定量分析方法,测定大鼠在不同给药剂量下血浆样品中单抗药物浓度,绘制贝伐珠单抗的药物浓度-时间曲线,同时测定贝伐珠单抗糖基化修饰的17种糖型的相对含量,绘制相对含量-时间曲线,考察单抗药物本身及其糖基化修饰在体内的药代动力学特征,为药物研发和临床安全用药的研究提供新的途径及理论依据。研究方案利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对完整贝伐珠单抗的分子量进行表征;利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对贝伐珠单抗在完整蛋白层次以及轻、重链层次考察其糖基化修饰情况;通过对贝伐珠单抗进行胰蛋白酶水解,采用shot-gun蛋白质组学策略对贝伐单抗的实际胰蛋白酶水解产生的肽段进行全面分析表征;通过对贝伐珠单克隆抗体药物进行胰蛋白酶水解,同时利用肽糖苷酶F(Peptide-N-glycosidase F,PNGase F)进行去糖基化处理,结合高分辨质谱技术和搜库软件实现对贝伐珠单抗糖基化修饰的全面表征,确定其糖基化修饰位点及存在糖型。通过对贝伐珠单抗药物进行胰蛋白酶水解,采用shot-gun蛋白质组学策略筛选出能代表贝伐珠单抗的特征肽段;利用液相色谱-串联质谱联用技术(Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS),通过优化液相条件与质谱参数,采用平行反应监测模式(Parallel reaction monitoring,PRM)建立针对贝伐珠单抗特征肽段的LC-MS/MS测定方法;通过胰蛋白酶酶解结合固相萃取技术实现血浆样品的制备;实验中合成稳定同位素标记的特征肽段做内标,通过内标法建立贝伐珠单抗大鼠血浆标准曲线;最后,通过测定大鼠给药后血浆样本,得到不同给药剂量下的贝伐珠单抗的药物浓度-时间曲线。利用lc-ms/ms技术,通过优化液相条件与质谱参数,采用prm模式,建立针对贝伐珠单抗糖基化修饰各糖型的lc-ms/ms测定方法;通过胰蛋白酶酶解结合固相萃取技术实现血浆样品的制备;通过测定大鼠给药后血浆样本,考察不同给药剂量下的糖基化修饰变化情况;通过优化亲水富集条件确定亲水富集样品制备方法;最后,通过对血浆样品直接分析未检测到的糖型进行亲水富集,考察利用亲水富集手段检测实际样品的优势。研究结果本研究建立了对贝伐珠单抗及其糖基化修饰的质谱定性分析方法。结果表明贝伐珠单抗分子量约为150kda,轻链分子量约为25kda,重链分子量约为50kda,糖基化修饰中的糖链分子量主要集中在2~4kda。贝伐珠单抗的n-糖基化修饰位点位于重链的第303位天冬酰胺残基上。经胰蛋白酶水解后,糖基化修饰所在的肽段序列为eeqynstyr。利用建立的方法表征到贝伐珠单抗的17种糖型,包括h3n3、h4n4、h3n4、h4n3f1、h4n4f1、h3n3f1、h3n4f1、h3n5f1、h5n2、h6n2、h5n4f1、h8n2、h5n5、h4n3f1s1、h5n3f1、h6n3f1和h4n5。本研究确定了贝伐珠单抗的特征肽段,序列为ftfsldtsk,并合成了稳定同位素标记的肽段做内标,建立了对复杂基质中的贝伐珠单抗的prm定量方法。用于对特征肽段及内标肽段进行prm监测的母离子质荷比(mass-to-chargeratio,m/z)分别为523.26和526.88,提取离子m/z分别为797.39和805.41,采用内标法建立了贝伐珠单抗大鼠血浆标准曲线,线性范围为0.005-1.2μg/μl,标准曲线为y=0.0684449x-0.000239987(r2=0.9980)。对高低剂量给药的大鼠血浆样品进行了检测,获得的药物浓度-时间曲线趋势一致。本研究同时对贝伐珠单抗的糖基化修饰的17种糖肽进行了定量分析。结果表明,不同糖型在体内的代谢情况也不完全一致。同时提供了一种亲水富集糖肽的方法,为低丰度糖肽的分析提供了更具优势的方法。通过以上实验,建立了对单克隆抗体药物及其糖基化修饰的定性、定量分析方法,为药物代谢动力学研究提供了新思路、新方法。
【关键词】：单克隆抗体药物 糖基化修饰 液相色谱-串联质谱联用技术 平行反应监测 绝对定量
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R917
【目录】：

• 摘要4-7
• abstract7-13
• 第1章 绪论13-23
• 1.1 单克隆抗体药物简介13-15
• 1.2 基于MRM技术的蛋白药物定量方法15-17
• 1.3 单克隆抗体药物糖基化修饰简介17-18
• 1.4 单抗药物糖基化修饰分析方法18-22
• 1.4.1 整体蛋白水平的MS分析和CE分析18-19
• 1.4.2 糖链水平的分析19-20
• 1.4.3 糖肽水平的直接分析20-21
• 1.4.4 糖肽水平的富集分析21-22
• 1.5 实验目的及研究方案22-23
• 第2章 单克隆抗体药物及其糖基化修饰的表征23-39
• 2.1 实验目的23
• 2.2 实验部分23-27
• 2.2.1 仪器与设备23
• 2.2.2 药品与试剂23-24
• 2.2.3 溶液配制24
• 2.2.4 色谱与质谱条件24
• 2.2.5 数据处理24-25
• 2.2.6 完整贝伐珠单抗的稀释及去糖基化25
• 2.2.7 完整单抗及其糖基化修饰的MALDI-TOF MS表征25-26
• 2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳26
• 2.2.9 贝伐珠单抗标准品的酶解及去糖基化26-27
• 2.3 结果与分析27-39
• 2.3.1 基于MALDI-TOF MS表征完整单抗及其糖基化修饰27-29
• 2.3.2 基于SDS-PAGE的单抗药物表征29-30
• 2.3.3 基于LC-MS/MS的单抗药物胰蛋白酶酶解考察30-32
• 2.3.4 贝伐珠单抗糖基化的表征32-39
• 第3章 单克隆抗体药物的体内定量分析方法39-46
• 3.1 实验目的39
• 3.2 实验部分39-42
• 3.2.1 仪器与设备39
• 3.2.2 药品与试剂39
• 3.2.3 给药方案与血浆样品采集39-40
• 3.2.4 色谱与质谱条件40
• 3.2.5 贝伐珠单抗标准系列溶液及内标肽段溶液的配制40-41
• 3.2.6 标准曲线样品的制备41
• 3.2.7 大鼠血浆样品的酶解41-42
• 3.3 结果与分析42-46
• 3.3.1 特征肽段的确定及色谱、质谱条件的优化42-44
• 3.3.2 大鼠血浆标准曲线的建立44
• 3.3.3 不同剂量给药大鼠血浆的测定44-46
• 第4章 单克隆抗体药物糖基化修饰的质谱分析方法46-65
• 4.1 实验目的46
• 4.2 实验部分46-49
• 4.2.1 仪器与设备46
• 4.2.2 药品与试剂46-47
• 4.2.3 给药方案与血浆样品采集47
• 4.2.4 色谱与质谱条件47-48
• 4.2.5 糖肽富集方法的优化48-49
• 4.2.6 大鼠血浆样品的酶解49
• 4.2.7 大鼠血浆样品的富集49
• 4.3 结果与分析49-65
• 4.3.1 大鼠血浆样品的测定49-62
• 4.3.2 糖肽富集方法的优化62-63
• 4.3.3 糖肽富集的优势63-65
• 第5章 结论与展望65-67
• 参考文献67-75
• 作者简介及科研成果75-77
• 致谢77

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本文编号：320821