双环醇对次黄嘌呤脱氢酶Ⅱ的作用及其抗炎机制研究

发布时间：2017-04-21 16:09

  本文关键词：双环醇对次黄嘌呤脱氢酶Ⅱ的作用及其抗炎机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：双环醇是中国医学科学院药物所研发的、具有我国自主知识产权的抗炎保肝药物,自2001年起,已在临床广泛应用至今。但其作用机制与靶点不明部分限制了临床应用。本论文目的是探索双环醇的潜在抗炎机制及靶点。前期利用中国科学院上海药物研究所TarFisDock网络反式分子对接系统对双环醇与PDTD数据库中的蛋白质进行虚拟分子对接,发现次黄嘌呤脱氢酶Ⅱ(inosine 5'-monophosphate dehydrogenase Ⅱ, IMPDHⅡ)与双环醇潜在结合能力最强。为考察IMPDHⅡ是否为双环醇作用靶点,本部分论文首先采用小鼠原代脾淋巴细胞增殖模型、人外周血单个核细胞(human peripheral blood monouclear cells, hPBMC)增殖模型及IMPDHⅡ酶促反应动力学模型,考察双环醇对IMPDH II酶活性的影响。结果显示1μM、5μM的双环醇能显著抑制5μg/mLconcanavalinA (conA)刺激的小鼠原代脾淋巴细胞增殖；双环醇对5μg/mL phytohemagglutinin (PHA)刺激的人外周血单个核细胞增殖有抑制的趋势(仅两次实验)；在IMPDHⅡ酶促反应动力学模型中,低浓度双环醇(0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, 10μM)具有促进IMPDHⅡ酶活的趋势,而高浓度双环醇(5OμM, 100μM,200μM)具有抑制]MPDHⅡ酶活性的趋势,但均不具统计学意义。以上结果提示双环醇并不是传统意义的IMPDH ⅡI酶活性抑制剂。进一步考察双环醇对IMPDHⅡ生物学功能的影响。结果显示,双环醇可促进活化的TLR2受体对ⅡMPDH Ⅱ的募集作用,募集IMPDHⅡ的TLR2无法向下游传递炎症信号,继而抑制下游NF-κB通路的激活与细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的释放。这可能为双环醇抗炎机制之一。论文第一部分工作显示,在单核细胞,双环醇能够通过促进IMPDH Ⅱ进入脂阀,与活化的TLR2结合,进而影响TLR2下游炎症通路,减少炎症因子的释放,发挥抗炎活性。在本部分实验中,利用组织中的免疫细胞--巨噬细胞进一步考察双环醇的抗炎作用及机制。鉴于近年来双环醇在非酒精性脂肪肝治疗中疗效良好,我们也同时考察了双环醇对同时参与炎症及代谢作用的代谢性核受体表达的影响。50ng/mL佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)作用人单核细胞THP-1细胞2天,该细胞分化为巨噬细胞。利用300ng/mL pam3刺激THP-1巨噬细胞6h以激活TLR2受体,同时考察双环醇的作用。ELISA结果显示,5、10、50μM双环醇对pam3束(?)激的巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放均表现出良好的抑制活性。Western结果显示,在pam3刺激TLR2活化的NF-κB经典通路中,双环醇可显著降低NF-κ,B通路上游PI3K的表达,抑制AKT、IKK的磷酸化水平,进而降低IκB蛋白的磷酸化,减少IκB的降解,抑制NF-κB入核,减少炎症因子的释放。对于在炎症及代谢中均发挥重要作用的代谢性核受体PPARy、LXRα与RXRα,双环醇对PPARy表现出剂量依赖性的激活作用。在本论文第三部分工作中,利用经典的免疫激活剂脂多糖(LPS)刺激TLR4受体激活人THP-1巨噬细胞,进一步考察双环醇对LPS/TLR4引起炎症反应的作用及机制。同时分析与pam3/TLR2通路的异同。ELISA结果显示,双环醇对LPS/TLR4引起的巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放亦有显著抑制活性,但双环醇对TLR4表达,Akt、IKK磷酸化均无明显影响,却能抑制PI3K的表达,显著促进IκB,抑制IrB磷酸化,进而抑制NF-κB入核。进一步的western结果显示：双环醇对未受刺激及受刺激的巨噬细胞均显著上调PPARy的表达。利用siRNA技术对PPARy进行干扰后,western结果显示,双环醇仍能够上调PPARy的表达,但激活作用不及干扰前。且PPARy干扰后,双环醇对IκB表达的促进作用亦随之降低,提示双环醇对IκB表达的上调作用可能是部分通过PPARy而引起。同时,在PPARy干扰后,双环醇抑制LPS刺激巨噬细胞所致细胞因子(TNF-α、IL-1β)的释放及基因表达(TNF-α)升高的作用有所减弱,进一步提示双环醇对PPARy的促表达作用可能是其促IκB表达而发挥抗炎作用的机制。
【关键词】：双环醇 次黄嘌呤脱氢酶Ⅱ TLR2 淋巴细胞 NF-κB 双环醇 TLR2 NF-κB 细胞因子 PPARγ 双环醇 PPARγ TLR4 NF-κB 细胞因子 小干扰RNA 葡萄糖激酶
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 第一部分 双环醇对次黄嘌呤脱氢酶Ⅱ的作用7-9
• 中文摘要7
• 英文摘要7-8
• 小结8-9
• 第二部分 双环醇对pam3刺激巨噬细胞TLR2信号传导通路的影响及机制9-11
• 中文摘要9
• 英文摘要9-10
• 小结10-11
• 第三部分 双环醇对LPS刺激巨噬细胞TLR4信号传导通路的影响及机制11-13
• 中文摘要11
• 英文摘要11-12
• 小结12-13
• 全文总结13-15
• 第一部分 双环醇对次黄嘌呤脱氢酶Ⅱ的作用15-38
• 前言15-16
• 材料与方法16-25
• 实验结果25-33
• 1. 双环醇与IMPDHⅡ的虚拟分子对接结果25-26
• 2. 双环醇对conA刺激的小鼠原代脾淋巴细胞增殖的影响26-27
• 3. 双环醇对PHA刺激的人外周血单个核细胞增殖(hPBMC)的影响27-28
• 4. 双环醇对IMPDHⅡ酶促反应动力学的影响28-29
• 5. 双环醇对pam3激活的TLR2募集IMPDHⅡ的影响29-30
• 6. 双环醇对pam3激活的THP-1细胞IκB、NF-κB表达的影响30-31
• 7. 双环醇对pam3激活THP-1单核细胞细胞因子释放的影响31-33
• 讨论33-36
• 参考文献36-38
• 第二部分 双环醇对pam3刺激巨噬细胞TLR2信号传导通路的影响及机制38-52
• 前言38-39
• 材料与方法39-43
• 实验结果43-48
• 1. PMA刺激单核细胞THP-1分化为巨噬细胞的条件探索43
• 2. 双环醇对pam3刺激的巨噬细胞细胞因子释放的影响43-44
• 3. 双环醇对pam3刺激巨噬细胞TLR2后NF-κB经典通路的影响44-46
• 4. 双环醇对具抗炎作用的代谢性核因子表达的影响46-48
• 讨论48-50
• 参考文献50-52
• 第三部分 双环醇对LPS刺激巨噬细胞TLR4信号传导通路的影响及机制52-72
• 前言52
• 材料与方法52-58
• 实验结果58-69
• 1. 双环醇对LPS刺激的巨噬细胞细胞因子释放的影响58
• 2. 双环醇在巨噬细胞对LPS刺激TLR4后NF-κB经典通路的影响58-60
• 3. 双环醇对LPS刺激的巨噬细胞代谢性核因子表达的影响60-61
• 4. 双环醇对未刺激的巨噬细胞PPARγ表达的影响61-62
• 5. 双环醇对未刺激巨噬细胞siRNA干扰PPARγ后的PPARγ、IκB表达的影响62-64
• 6. 双环醇对LPS刺激siRNA干扰后巨噬细胞的PPARγ、IκB表达的影响64-65
• 7. 双环醇对LPS刺激的siRNA干扰后巨噬细胞细胞因子释放的影响65-66
• 8. 双环醇对LPS刺激的siRNA干扰后巨噬细胞TNF-α mRNA转录量的影响66-68
• 9. 双环醇对葡萄糖激酶(GK)酶活性的影响68-69
• 讨论69-71
• 参考文献71-72
• 附录 双环醇对雷公藤多苷片及抗肿瘤药物诱导肝损伤的保护作用及机制研究72-83
• 中文摘要72-73
• Abstract73-74
• 前言74
• 材料与方法74-76
• 实验结果76-81
• 1. 双环醇对雷公藤多苷致肝损伤小鼠血清生化指标的影响76-77
• 2. 双环醇对雷公藤多苷致小鼠肝损伤肝脏病理结果77-78
• 3. 双环醇对雷公藤多苷致小鼠肝损伤肝组织蛋白表达情况78-79
• 4. 雷公藤甲素对WB-F344细胞胞间通讯功能的影响79
• 5. 双环醇对CDDP联合GEM致肝肾损伤荷瘤小鼠血清生化指标的影响79-80
• 6. 双环醇对CDDP联合GEM致肝肾损伤荷瘤小鼠抑瘤率及死亡率影响80-81
• 讨论81-82
• 参考文献82-83
• 综述83-96
• 参考文献93-96
• 致谢96-97
• 个人简历97
• 发表文章和参加会议97-98

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 涂峗;万以叶;;双环醇片对肺癌患者药物性肝损伤的防治研究[J];医学研究杂志;2012年07期

2 胡小鹏;尹航;王玮;杨晓勇;任亮;刘航;车乐;张小东;;双环醇片治疗肾移植术后药物性肝损伤的疗效观察[J];胃肠病学和肝病学杂志;2012年04期

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本文编号：320693