D-对羟基苯甘氨酸生物合成酶的优化及固定化研究

发布时间：2017-05-05 17:06

  本文关键词：D-对羟基苯甘氨酸生物合成酶的优化及固定化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的1对海洋沉积物进行系列性筛选,以获得全新来源并具有潜在高性能的海因酶,并提供一种全新的海因酶阳性菌筛选体系和一种全新的酶优化手段。2构建快速筛选模型,筛选性能更优的海因酶突变体,并为同类酶的优化提供依据。3对海因酶工程菌进行固定化研究,获得全细胞固定海因酶产生菌的最优配方,为D-对羟基苯甘氨酸的工业化生产奠定基础。方法1以实验室保存的链霉菌库为筛选对象,利用唯一氮源法、双层琼脂法、微孔快速筛选法和分子生物学筛选法对其进行系列性筛选,获得可表达海因酶的阳性链霉菌;从筛选获得阳性菌中扩增目的片段,分析基因序列并进行工程菌构建;测定海因酶的酶活和动力学参数;利用Swiss-model在线软件对海因酶进行在线同源建模和Caver Analyst软件对其的催化通道进行结构模拟分析;2利用易错PCR构建海因酶突变库;构建快速筛选模型进行突变酶筛选;对突变酶的酶学性质进行测定;3利用海藻酸钠作为固定载体,对海因酶工程菌进行全细胞固定化研究;优化海藻酸钠浓度、硅藻土浓度、戊二醛浓度、Ca Cl2浓度和Mn Cl2浓度;测定固定化小球的最适直径和最适添加浓度;测定固定化全细胞小球的批次实验次数;测定固定化全细胞小球的机械强度。结果1筛选获得四株阳性菌,分别命名为S1、S14、S29和S145菌株,随后对不同菌株来源的海因酶的酶动力学参数进行测定,结果显示,S145菌株来源的海因酶活性最高,为9.7 U/mg,催化动力学常数Kcat=3.2×10-6/s,Km=9.5 mmol/L;海因酶结构的同源模建和催化通道模拟分析,结果显示其主要催化通道Tunnel_1长度为9.1?,瓶颈氨基酸残基为50位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18?;潜在催化通道Tunnel_2长度为13.6?,瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52?;2筛选出七株阳性突变菌,突变位点主要集中在181位和286位;181位突变菌的酶活为11.5 U/mg,对产物的耐受力提高10%;286位突变菌的酶活为11.0 U/mg,对底物的耐受力提高11%;3获得固定化细胞的最优配方为:3.0%海藻酸钠、1.5%硅藻土、0.05%Ca Cl2和1.0 m M Mn Cl2;固定化小球最适直径位2.6 mm,所占浓度最适为20%;固定化全细胞小球可重复使用12批次,其催化生产产物的产率为88%以上。结论1开发了一种海因酶系列筛选策略,获得潜在的酶优化位点,为后期酶的优化提供理论基础;2筛选获得了性能更优的突变海因酶;3制备了高性能固定化细胞的固定化配方,从而为酶法工业生产D-对羟基苯甘氨酸成为可能。
【关键词】：D-海因酶 D-对羟基苯甘氨酸 D-苯海因 海洋链霉菌 CaverAnalyst 定向进化 海藻酸钠 全细胞固定
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-44
• 1.1 材料与方法13-27
• 1.1.1 材料13-18
• 1.1.2 方法18-27
• 1.2 结果27-38
• 1.2.1 菌种的分离、纯化和鉴定27-28
• 1.2.2 海因酶工程菌构建28-29
• 1.2.3 海因酶的表达与动力学参数测定29-30
• 1.2.4 基于 16S rRNA的同源分析30
• 1.2.5 海因酶催化通道的分子模拟分析30-31
• 1.2.6 海因酶突变库的构建及筛选31-32
• 1.2.7 突变酶活力的测定32
• 1.2.8 海因酶的酶学性质测定32-34
• 1.2.9 固定化全细胞的各项参数优化34-38
• 1.2.10 固定化全细胞小球批次实验测定38
• 1.3 讨论38-40
• 1.4 结论40
• 参考文献40-44
• 第2章 综述44-59
• 2.1 海因酶产生菌的筛选方法45-47
• 2.1.1 唯一氮源法45
• 2.1.2 双层琼脂法45-46
• 2.1.3 微孔快速筛选法46
• 2.1.4 分子生物学筛选法46-47
• 2.2 海因酶的定向进化47-50
• 2.2.1 易错PCR47-48
• 2.2.2 DNA shuffling48-49
• 2.2.3 随机引物体外重组法49-50
• 2.3 酶的固定化研究50-52
• 2.3.1 酶的固定化技术50-51
• 2.3.2 细胞的固定化技术51-52
• 2.4 结论和展望52-53
• 参考文献53-59
• 结论59-60
• 致谢60-61
• 导师简介61-63
• 作者简介63-66
• 学位论文数据集66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李亚东;汪康游;樊帅;杨兆勇;田喜凤;许乐幸;金媛媛;;海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析[J];农业生物技术学报;2016年05期

2 张长利;王景晶;杨宏;;细胞固定化技术研究进展及其在水处理领域的应用[J];水处理技术;2013年06期

3 李海凤;曾红宇;许岗;杨兆勇;;D-海因酶固定化的研究及展望[J];中国医药生物技术;2013年02期

4 刘芳;于建生;;细胞固定化及其在酿酒工业中的应用研究进展[J];酿酒科技;2013年08期

5 王培;曹建华;宋德贵;辜澜涛;董研玲;;一株产海因酶菌种的筛选与鉴定[J];广西师范大学学报(自然科学版);2013年01期

6 张佳宁;宋云花;王s，

本文编号：346733