α7nAChR对多发性骨髓瘤细胞促血管生成功能的影响及其机制研究

发布时间：2017-05-13 19:10

  本文关键词：α7nAChR对多发性骨髓瘤细胞促血管生成功能的影响及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的:多发性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是以骨髓中浆细胞恶性克隆性增殖且肿瘤细胞与骨髓微环境密切联系来支撑MM细胞生长和增殖,为主要特征的一种恶性肿瘤。MM的发病率占血液系统恶性肿瘤的10%左右,MM具有侵袭性强、易耐药和血管生成显著等特点,使绝大多数患者进入难治或复发阶段。因此对MM的治疗提出新的挑战,也使其成为血液系统恶性肿瘤研究的热点。α7尼古丁乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR),是尼古丁乙酰胆碱受体的一个亚型。α7nAChR广泛分布于中枢和周围神经系统,近年来发现其在上皮细胞、免疫细胞以及肺癌细胞等细胞上也有表达;其生物学功能也涉及到了认知、炎症调控、癌症发展等多个方面。研究发现给予胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐可促进缺血组织中的血管新生,使用α7nAChR抑制剂MG624可以抑制肺癌中的血管新生。有文献报道,在MM的发生发展过程中,血管生成具有十分重要的作用。2013白血病杂志也指出,骨髓瘤患者预后效果与血管生成关系密切,当患者骨髓中新生血管显著增多时,患者一般预后较差。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的最重要的正向调控血管生成的细胞因子,在多种恶性肿瘤中高表达,如胃癌,鼻咽癌及骨髓瘤等。且研究发现VEGF的高表达可能与MM的血管生成及不良预后有关。源自于神经外胚层及中胚层细胞的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)也是研究较多的促进血管生成的细胞因子之一。b FGF在多种恶性肿瘤中也存在过表达的现象,可与VEGF协同作用促进肿瘤的发展进程。有研究指出血小板反应素-1(Thrombospond1n-1,TSP-1)又称为血小板反应蛋白-1,是一种内源性血管生成抑制剂,主要由血小板,内皮细胞及肿瘤细胞等分泌,可通过直接影响血管内皮细胞的增殖、凋亡和迁移以及拮抗VEGF来发挥抑制血管生成的作用。研究表明,TSP-1可作为前列腺癌,甲状腺乳头癌及非小细胞肺癌等肿瘤的辅助诊断指标。目前关于α7nAChR与MM尚无研究报道。因此,本课题围绕α7nAChR是否在多发性骨髓瘤细胞促血管生成的过程中发挥作用开展研究并探讨其可能的机制。研究内容及结果:选取MM细胞株U266及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为主要的研究对象,并利用PNU-282987(α7nAChR的选择性激动剂)和MLA(α7nAChR的选择性拮抗剂)为主要的研究药物,利用细胞与细胞之间通过Transwell小室间接共培养方式来模拟骨髓微环境,进而开展研究。1.U266细胞表达α7nAChR利用Western blot检测U266细胞中α7nAChR蛋白表达,选取RAW264.7及HUVECs作为α7nAChR表达的阳性对照。结果提示,U266细胞也表达α7nAChR。激光共聚焦显微镜下检测到U266细胞可被α7nAChR抗体(绿色荧光,主要分布在细胞膜)及DAPI(蓝色荧光,主要分布在细胞核)共定位,也进一步证明U266细胞表达α7nAChR。2.不同浓度的PNU-282987对U266细胞活力的影响采用CCK8检测不同浓度的α7nAChR激动剂PNU-282987(1,10,50μM)处理U266细胞6h后的细胞活力,发现50μM的PNU-282987使U266细胞活力下降;1μM和10μM的PNU-282987对U266细胞活性几乎无影响。后续实验中选取10μM的PNU-292987预处理U266细胞6h。3.不同浓度的MLA对U266细胞活力的影响采用CCK8检测不同浓度α7nAChR拮抗剂MLA(100,200,300,400,500μM)处理U266细胞6h后的细胞活力,发现300μM,400μM及500μM的MLA使U266细胞活力下降;100μM和200μM的MLA对U266细胞活性影响不明显。后续实验中选取200μM的MLA预处理U266细胞6h。4.PNU-282987对HUVECs细胞活力及小管生成能力的无明显影响选用PNU-282987(10μM)预处理细胞24h,然后测定HUVECs的细胞活力及小管生成能力。发现,与对照组相比,差异无统计学意义。5.U266与HUVECs共培养,测定HUVECs的小管生成能力选用PNU-282987(10μM),MLA(200μM),MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)预处理U266细胞6h后,去掉药物,将其与预先铺板的HUVECs共培养,测定共培养24h后的HUVECs小管生成能力。结果表明,和单独培养HUVECs相比,U266细胞与HUVECs共培养后可提高其小管生成能力;使用PNU-282987预处理之后的U266细胞再与HUVECs共培养,可使其促进HUVECs的小管生成能力下降;使用α7nAChR的拮抗剂MLA(200μM)+PNU-282987(10μM)预处理U266细胞后与HUVECs共培养,能够阻断PNU-282987预处理U266导致的共培养后HUVECs小管生成能力下降的现象。另外使用MLA单独或与PNU-282987联合处理U266细胞6h后再将其与HUVECs共培养,与U266细胞与HUVECs共培养后的HUVECs的小管生成能力相比,其差异并无统计学意义。6.PNU-282987激动U266细胞的α7nAChR会降低共培养后HUVECs的小管生成能力,可能与b FGF的表达水平下调有关VEGF是主要的血管生长促进因子,TSP-1是内源性的抑制血管生长因子。由前期结果可知,U266细胞与HUVECs共培养24h后,可提高其小管生成能力;使用PNU-282987预处理U266细胞后,促HUVECs小管生成能力却下降。这一现象说明,U266细胞可能产生某些促血管生成因子或减少了抑制血管生成因子的释放,经PNU-282987预处理后,这一作用被抑制。为了探讨可能的机制,我们首先选用ELISA检测U266细胞经PNU-282987(0,10μM)预处理6h及去掉药物作用继续培养24h后,细胞培养上清中的VEGF及TSP-1的含量。结果表明,PNU-282987并不影响U266细胞分泌VEGF及TSP-1的水平。然后我们选用血管生成相关细胞因子抗体芯片(同时检测20个血管生成相关的细胞因子)对去掉PNU-282987(0,10μM)作用后继续培养24h的U266细胞上清进行检测,发现PNU-282987预处理后可降低U266细胞分泌b FGF的水平。结论:α7nAChR参与了U266细胞与HUVECs共培养的血管生成过程,PNU-282987激动U266细胞的α7nAChR会降低共培养后HUVECs的小管生成能力,这一现象可能与U266细胞分泌的促血管生长因子b FGF的表达水平下调有关。研究背景及目的:多发性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是以骨髓中浆细胞恶性克隆性增殖并伴有单克隆免疫球蛋白分泌为主要特征的一种血液系统恶性肿瘤。MM好发于老年人,随着人口老龄化的加剧,MM的发病率有逐年增高的趋势,放疗与化疗是治疗MM的主要手段。地塞米松(dexamethasone,DEX)是糖皮质激素类衍生物,具有抗炎、抗休克、免疫抑制等药理作用。近年来,依照《中国多发性骨髓瘤诊治指南》指导,DEX作为MM化疗方案中的基础药物在临床使用。氯喹(chloroquine,CQ)是治疗疟疾的经典药物,“老药新用”是目前氯喹研究的新方向。已有文献报导,CQ具有抗肿瘤的作用。Tang等研究表明CQ能够增加吉非替尼对非小细胞肺癌的细胞毒性;Han等发现CQ可以增加乳腺癌细胞的放射敏感性。低氧诱导因子1(hypoxia induced factor 1,HIF-1)是一种在缺氧条件下普遍存在的异源二聚体核转录因子,有α及β亚单位组成,其中α亚单位决定其活性。与其他肿瘤不同的是,多发性骨髓瘤细胞处于相对密闭的缺氧骨髓微环境中,因此研究HIF-1α对于进一步了解骨髓瘤的发生发展过程具有十分重要的意义。B细胞淋巴瘤-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)是抗凋亡家族的一员,是细胞凋亡通路中线粒体途径的关键调节分子,主要作用于线粒体外膜。染色体异位能够诱导Bcl-2蛋白过表达,促使肿瘤的发生。故本课题针对CQ与DEX或辐射联用后对MM细胞株U266的杀伤作用开展研究,并对其可能的机制进行初步探讨。研究内容及结果:选取MM细胞株U266为研究对象,CQ及DEX为研究药物,60Co-γ线照射为辐射方式,进而开展研究。1.CQ及DEX均浓度依赖性地抑制U266细胞的增殖配制一系列浓度的CQ(终浓度为:1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0,1.0μM,2倍比稀释)及DEX(终浓度为:2000,1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0μM,2倍比稀释),选取对数生长期的U266细胞,接种于96孔板中。药物处理U266细胞24h后,每孔加入10ul的CCK8检测试剂,在450nm处检测吸光度,计算细胞的增殖率(%)及抑制率(%)。结果显示:CQ及DEX对U266细胞的增殖抑制作用均呈浓度依赖性,且CQ对U266细胞的半数致死浓度IC50约为77.9μM,DEX对U266细胞的IC50约为237.1μM。2.CQ增强化学药物DEX对U266细胞的增殖抑制作用选用不同浓度的CQ(终浓度为:125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9μM)与DEX(终浓度为:250,125μM)联用,并设置了相应的单药浓度组处理细胞。药物作用24h后加入CCK-8试剂,检测各孔的吸光度。利用中效原理软件(Compusyn软件),求出两药合用时的联用指数(Combination index,CI)。结果发现:当DEX浓度为125μM,CQ:DEX(c/c)在1:32~1:4时,CI"f1,说明两药协同或相加作用杀伤U266细胞;CQ:DEX(c/c)在1:2~1:1时,CI1,说明CQ与DEX联用是拮抗作用。当DEX浓度为250μM,CQ:DEX(c/c)在1:64~1:8时,CI1,两药联用后为协同作用;CQ:DEX(c/c)在1:4~1:2时,CI"g1,两药联用后为拮抗或相加作用。值得一提的是,DEX单药浓度为125μM时,对U266细胞的抑制率约为30%;CQ单药浓度为7.8μM及3.9μM时,细胞抑制率约为8%;但当DEX与CQ联用时,细胞抑制率分别增加到了45%及36%,且此时两药的CI均1,表现为协同杀伤作用。考虑到高浓度的DEX与低浓度的CQ联用时,DEX发挥主要的抑制细胞增殖作用,故我们将这一现象表述为CQ增强DEX对U266细胞的杀伤作用。3.不同辐射剂量对U266细胞的杀伤作用差异不明显为了研究放疗对MM细胞的杀伤作用,我们首先选取了不同的辐射剂量(5,10,15,20,5Gy)来照射U266细胞。与0Gy(对照组)相比,不同剂量的辐射使U266细胞的增殖能力下降,增殖率降为80%左右;但各组之间的差异并无统计学意义。4.CQ增敏辐射对U266细胞的杀伤作用细胞分组为:对照组,CQ组(1μM),辐射组(5Gy),辐射+CQ组。采用CCK-8法及流式细胞术分别检测细胞增殖率及凋亡率。结果表明:CQ单独给药对U266细胞的增殖及凋亡几乎无影响;辐射后,U266细胞增殖能力下降,凋亡比例增加;给予CQ预处理后再进行辐射,细胞的增殖率下降更明显,凋亡程度增加地更显著。5.CQ增强DEX对U266细胞的杀伤作用可能与Bcl-2蛋白的表达下调有关通过Western blot方法分别检测了CQ与化学药物DEX或辐射联用后的细胞内的HIF-1α和Bcl-2蛋白的表达。结果提示:CQ与DEX或辐射联用并不影响U266细胞内HIF-1α的表达;U266细胞经3.9μM的CQ处理后,Bcl-2蛋白水平无明显变化;经125μM的DEX处理后,胞内Bcl-2的表达下降;当两药合用后,Bcl-2蛋白表达水平显著下降。提示,CQ增敏DEX对U266细胞的杀伤作用可能与抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调有关。但是,CQ预处理U266细胞后再辐射,检测Bcl-2的表达,其差异无统计学意义。结论:传统抗疟药CQ能够增强化学药物DEX或辐射对于MM细胞U266的杀伤作用,且CQ增敏DEX杀伤U266细胞的机制可能与抑制Bcl-2蛋白的表达有关。
【关键词】：α7尼古丁乙酰胆碱受体 多发性骨髓瘤细胞U266 人脐静脉内皮细胞 血管生成 氯喹 地塞米松 辐射 多发性骨髓瘤细胞U266 增敏
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 课题一 α7nAChR对多发性骨髓瘤细胞促血管生成功能的影响及其机制研究 Role of α7nAChR in the angiogenesis induced by multiple myeloma cell5-47
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-28
• 实验结果28-38
• 讨论38-42
• 结论42-43
• 参考文献43-47
• 课题二 氯喹增敏地塞米松或辐射对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用 Chloroquine sensitizes cytotoxic effects of dexamethasone or radiation on multiple myeloma cells47-77
• 摘要48-51
• Abstract51-54
• 缩略词表54-55
• 前言55-57
• 材料和方法57-60
• 实验结果60-70
• 讨论70-73
• 结论73-74
• 参考文献74-77
• 附录77-78
• 综述 Targeting α7 nicotinic acetylcholine receptor to combat inflammation In cardio-cerebral-vascular diseases78-92
• References86-92
• 硕士在读期间发表论文和参加科研情况92-93
• 致谢93

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 汪海,刘传缋;哺乳动物脑烟碱型乙酰胆碱受体的研究进展(综述)[J];中国应用生理学杂志;1992年02期

2 安静;邬礼政;周志斐;王小竞;;α7 nAChR在上皮组织的表达及其功能的研究进展[J];现代生物医学进展;2014年06期

3 ;Comparative and statistical analysis of nAChR sequences: An ab initio approach to the origin of molecular discrimination[J];Chinese Science Bulletin;2012年05期

4 田建英;杨浩;;nAChR介导茶多酚EGCG的神经保护作用[J];中国药理学通报;2007年11期

5 李化兵;韩秀珍;冯益真;王金荣;孙妍;孙立峰;伊迎春;李志鹏;;nAChR_(α7)在条件免疫反应治疗小鼠支气管哮喘中的作用机制[J];山东大学学报(医学版);2009年07期

6 陆纲,宫明,陈瑞华,贾弘y

本文编号：363380