脂质纳米粒介导的基因与化药联合治疗乳腺癌肿瘤干细胞的研究

发布时间：2017-05-14 10:00

  本文关键词：脂质纳米粒介导的基因与化药联合治疗乳腺癌肿瘤干细胞的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乳腺癌肿瘤干细胞(Breast cancer stem cells, BCSC)具有无限增殖、自我更新和多向分化能力,是乳腺癌无法治愈的根源。由于具有耐药性,BCSC对杀伤普通肿瘤细胞的化疗药物不敏感,单一的疗法往往不能达到理想的治疗效果。研究表明,恢复BCSC中下调的microRNA-200c (miR-200c)水平,能减少β-微管蛋白Ⅲ (class III beta-tubulin, TUBB3)的表达,从而提高其对化疗药物紫杉醇(Paclitaxel, PTX)的敏感性。本研究旨在构建基于脂质纳米粒的给药系统,分别递释基因miR-200c及PTX。期望达到克服乳腺癌肿瘤干细胞对紫杉醇的耐药性,并有效杀灭乳腺癌肿瘤干细胞,实现基因与化药的联合治疗作用。在本课题组前期研究中,固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)是表面带负电荷的纳米载体,本研究在脂质材料中加入一种阳离子脂质-DOTAP,通过溶剂扩散法制备SLN。加入DOTAP后,固体脂质纳米粒荷正电,随着DOTAP含量增加,SLN粒径变小。含20 wt% DOTAP的SLN呈类球形,粒径为28.4±4.2nm,表面电位为18.4±1.3mV。SLN通过静电作用密接带负电的miRNA,形成复合物SLN/miRNA.当SLN与miRNA复合的质量比为90时,复合物粒径为36.1±3.0nm,表面电位为14.7±0.9 mV。透射电镜照片显示复合物形态呈类球形。凝胶电泳实验及酶保护实验证实,阳离子SLN具有密接、保护miRNA的能力。体外释放实验表明,SLN/miRNA复合物构成中,载体与基因质量比越高,miRNA从复合物中的释放速率越慢。基于课题组的前期工作基础,本研究构建了含液体油脂成分的纳米结构脂质载体(Nanotractured lipid carriers, NLC).含20wt%油酸的NLC,粒径为56.1±9.0nm,表面电位为-17.1±0.2 mV。包封化药紫杉醇后,载紫杉醇脂质纳米粒(NLC/PTX)粒径及电位分别为64.5±3.3 nm,-16.4±0.3 mV.当紫杉醇的投药量为5%时,载药纳米粒包封率为73.33±2.03%,载药量为3.51±0.07%。体外释放实验中,NLC/PTX 48 h时药物的累计释放百分率超过70%。本研究以悬浮球培养法富集的BCSC作为体外细胞评价模型。实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验结果显示,经SLN/miR-200c复合物转染的细胞,24 h后其miR-200c的表达量比阳性对照LipofectamineTM2000提高了11.6倍,显示SLN能有效携载miR-200c进入细胞球。细胞球摄取荧光标记的FITC-SLN/ miRNA-CY3复合物后,观察不同时间点的细胞内荧光变化,并进行共定位分析,显示在12h时,大部分的miRNA可从复合物中释放。Western blot测定结果证实,转染SLN/miR-200c至BCSC后,能实现紫杉醇耐药相关蛋白(TUBB3)表达量的下调。共聚焦荧光显微镜观察NLC的细胞球摄取,结果显示细胞球整体荧光强度与孵育时间成正比,随着时间的延长,靠近球中心细胞的摄取量增加。采用酸性磷酸酶法(APH assay)测定细胞活力,转染剂量下的SLN对细胞球基本不呈现毒性,载体NLC的细胞毒性较小。乳腺癌干细胞经转染SLN/miR-200c复合物后,其对紫杉醇的敏感性明显增强。
【关键词】：乳腺癌肿瘤干细胞 miRNAs PTX SLN NLC 联合治疗
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第一章 固体脂质纳米粒/miRNA复合物的制备及理化性质研究14-24
• 1.1 试剂与仪器14-15
• 1.1.1 试剂14
• 1.1.2 仪器14-15
• 1.2 实验方法15-17
• 1.2.1 固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)的制备15
• 1.2.2 SLN的粒径与表面电位测定15
• 1.2.3 SLN/microRNA复合物的制备15
• 1.2.4 复合物粒径及表面电位测定15-16
• 1.2.5 SLN及SLN/miRNA复合物透射电子显微镜观察16
• 1.2.6 复合物凝胶阻滞分析16
• 1.2.7 核糖核酸酶保护实验16
• 1.2.8 复合物体外释放实验16-17
• 1.3 结果与讨论17-22
• 1.3.1 SLN粒径与表面电位17-18
• 1.3.2 SLN/miRNA复合物的粒径与表面电位18
• 1.3.3 纳米粒形态学观察18-19
• 1.3.4 凝胶阻滞分析19-20
• 1.3.5 核糖核酸酶保护实验20-21
• 1.3.6 复合物体外释放实验21-22
• 1.4 小结22-24
• 第二章 紫杉醇纳米结构脂质载体的制备及理化性质研究24-32
• 2.1 试剂与仪器24-25
• 2.1.1 试剂24
• 2.1.2 仪器24-25
• 2.2 实验方法25-27
• 2.2.1 纳米结构脂质载体(Nanostructured lipid carriors,NLC)的制备25
• 2.2.2 NLC粒径与表面电位测定25
• 2.2.3 NLC透射电子显微镜观察25
• 2.2.4 紫杉醇含量测定25-26
• 2.2.5 紫杉醇纳米结构脂质载体载药量与包封率的测定26
• 2.2.6 紫杉醇纳米结构脂质载体的体外药物释放26-27
• 2.2.7 荧光标记NLC的细胞摄取27
• 2.3 结果与讨论27-31
• 2.3.1 NLC粒径与表面电位27-28
• 2.3.2 纳米粒形态学观察28
• 2.3.3 紫杉醇含量测定28-29
• 2.3.4 紫杉醇纳米结构脂质载体的载药量与包封率29
• 2.3.5 紫杉醇纳米结构脂质载体的体外药物释放29-30
• 2.3.6 荧光标记NLC的细胞摄取30-31
• 2.4 小结31-32
• 第三章 固体脂质纳米粒/miRNA复合物与紫杉醇纳米结构脂质载体的联合治疗32-50
• 3.1 试剂与仪器32-33
• 3.1.1 试剂32-33
• 3.1.2 仪器33
• 3.2 实验方法33-39
• 3.2.1 悬浮球培养法富集乳腺癌肿瘤干细胞33
• 3.2.2 SLN/miRNA复合物的细胞内递释33-36
• 3.2.2.1 SLN/miRNA复合物的细胞球摄取33-35
• 3.2.2.2 SLN/miRNA复合物胞内释放35-36
• 3.2.2.3 SLN/miRNA复合物的细胞球毒性36
• 3.2.3 SLN/miRNA复合物对TUBB3 mRNA表达量的影响36-37
• 3.2.4 SLN/miRNA复合物对TUBB3蛋白表达量的影响37-38
• 3.2.5 脂质纳米载体(NLC)的细胞球毒性及摄取38-39
• 3.2.5.1 NLC的细胞球毒性38
• 3.2.5.2 NLC的细胞球摄取38-39
• 3.2.6 SLN/miRNA复合物与NLC/PTX的联合细胞球毒性试验39
• 3.3 结果与讨论39-49
• 3.3.1 倒置显微镜观察乳腺癌肿瘤干细胞39-40
• 3.3.2 SLN/miRNA复合物的细胞内递释40-44
• 3.3.2.1 SLN/miRNA复合物的细胞球摄取40-41
• 3.3.2.2 SLN/miRNA复合物胞内释放41-42
• 3.3.2.3 SLN/miRNA复合物的细胞球毒性42-44
• 3.3.3 SLN/miRNA复合物对TUBB3 mRNA表达量的影响44-45
• 3.3.4 SLN/miRNA复合物对TUBB3蛋白表达量的影响45
• 3.3.5 纳米结构脂质载体的细胞球毒性及摄取45-47
• 3.3.5.1 纳米结构脂质载体的细胞球毒性45-46
• 3.3.5.2 纳米结构脂质载体的细胞球摄取46-47
• 3.3.6 SLN/miRNA复合物与NLC/PTX的联合细胞球毒性试验47-49
• 3.4 小结49-50
• 结论50-52
• 参考文献52-58
• 综述58-75
• 参考文献69-75
• 作者简历75

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