3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫毒性和代谢的研究

发布时间：2017-05-18 15:18

  本文关键词：3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫毒性和代谢的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本论文通过用不同浓度的3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans),观察药物对秀丽隐杆线虫毒性效应、幼虫发育时间的影响、脂肪含量的影响及主要相关的己糖激酶基因和cyp-35家族基因表达水平的变化;并通过应用目的基因RNA干扰线虫和突变株线虫,研究3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫的毒性和代谢的影响。方法:用不同浓度的3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫,在普通光学显微镜下观察线虫的形态及幼虫发育时间的变化;抽提线虫总RNA,反转录得到cDNA用于实时荧光定量PCR,选择与3-溴丙酮酸毒性和代谢相关的基因—己糖激酶和cyp-35家族基因,测定相关基因的表达水平。克隆表达3个己糖激酶基因用于RNA干扰,同时应用药物代谢相关基因RNA干扰线虫和突变株线虫探讨3-溴丙酮酸在线虫体内的毒性及代谢机制。结果:1.2mmol/L的3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫,幼虫发育时间明显延长,与正常对照组比较有统计学意义(P0.05)。2.不同浓度的3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫24h后,记录线虫成活个数,用SPSS19.0软件计算出药物对线虫的半数致死浓度为12.7mmol/L。3.3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫24小时后,线虫的体细胞和生殖细胞均未出现细胞凋亡现象。4.3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫72小时后,线虫头部和肠道的脂肪储存增加。5.3-溴丙酮酸处理线虫后,实时荧光定量PCR测定结果显示hxk-1、hxk-2和hxk-3的表达上调。6.应用RNA干扰的方法沉默目的基因hxk-1、hxk-2、hxk-3,其中hxk-1、hxk-2干扰效果较好。3-溴丙酮酸作用于hxk-1、hxk-2和hxk-3干扰线虫,LC50均降低。7.通过MEGA5.05软件和Clustal W软件对线虫己糖激酶基因进行遗传进化相似性比较,秀丽隐杆线虫hxk-1与美洲板口线虫己糖激酶属于一个分支,遗传近似度较高。秀丽隐杆线虫hxk-2和hxk-3是一个分支,hxk-2和hxk-3近似度较高,与hxk-1遗传近似度较低。8.3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫后,实时荧光定量PCR测定结果显示cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5和cyp-35C1表达量均升高,其中cyp-35A1表达量升高最明显,CYP35家族中cyp-35B3表达量降低。9.3-溴丙酮酸作用于cyp-35A1突变株线虫、cyp-35A2突变株线虫、cyp-35A4RNA干扰线虫和cyp-35B3 RNA干扰线虫后,LC50均降低。结论:高浓度的3-溴丙酮酸对线虫具有毒性作用,低浓度的3-溴丙酮酸能抑制秀丽隐杆线虫幼虫发育,且具有浓度依赖性。线虫体内与3-溴丙酮酸作用相关的己糖激酶基因表达均有不同程度的上调,说明当3-溴丙酮酸抑制己糖激酶的活性时,线虫ATP产生减少,糖酵解通路反馈调节己糖激酶基因高表达,以合成更多的己糖激酶。秀丽隐杆线虫hxk-2和hxk-3遗传近似度较高,与hxk-1遗传近似度较低。参与3-溴丙酮酸药物代谢的细胞色素P450家族中cyp-35A1基因表达明显上调,其可能是秀丽隐杆线虫调控3-溴丙酮酸代谢的主要基因;而cyp-35B3基因表达下调,说明3-溴丙酮酸能够抑制cyp-35B3的表达,或cyp-35A1上调表达影响cyp-35B3的表达。
【关键词】：秀丽隐杆线虫 3-溴丙酮酸 己糖激酶 细胞色素P450 cyp-35
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-19
• 1.1 模式生物秀丽隐杆线虫简介10-11
• 1.2 秀丽隐杆线虫在药物毒理和药物代谢方面的研究进展11-15
• 1.2.1 秀丽隐杆线虫在药物毒理学方面的应用11-12
• 1.2.2 秀丽隐杆线虫细胞色素P450的研究进展12-14
• 1.2.3 秀丽隐杆线虫cyp-35 家族基因的研究进展14-15
• 1.3 秀丽隐杆线虫RNA干扰的原理和应用15-16
• 1.3.1 秀丽隐杆线虫RNA干扰的原理15-16
• 1.3.2 RNA干扰技术在秀丽隐杆线虫的应用16
• 1.4 3-溴丙酮酸的研究现状16-19
• 1.4.1 3-溴丙酮酸的药物特点和作用机制16-18
• 1.4.2 3-溴丙酮酸的研究进展18-19
• 第二章 材料和方法19-32
• 2.1 实验材料、试剂及仪器19-21
• 2.1.1 主要实验材料19
• 2.1.2 实验试剂19
• 2.1.3 主要培养基和缓冲液的配制19-20
• 2.1.4 主要实验仪器和设备20-21
• 2.2 试验方法21-32
• 2.2.1 秀丽隐杆线虫的培养21
• 2.2.2 秀丽隐杆线虫的同步化和保存21
• 2.2.3 3-溴丙酮酸作用于秀丽隐杆线虫21-22
• 2.2.4 吖啶橙染色药物处理后的秀丽隐杆线虫22
• 2.2.5 对药物处理的秀丽隐杆线虫进行脂肪染色22-23
• 2.2.6 秀丽隐杆线虫总RNA的提取和反转录23-24
• 2.2.7 hxk-1、hxk-2 和hxk-3 引物设计和表达量的测定24-25
• 2.2.8 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因的克隆25-28
• 2.2.9 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因的表达28-29
• 2.2.10 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 的沉默和RNA干扰效果验证29
• 2.2.11 3-溴丙酮酸作用于hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因沉默的线虫29-30
• 2.2.12 己糖激酶基因分子进化树的构建及亲缘关系分析30
• 2.2.13 cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5、cyp-35B3和cyp-35C1引物的设计与表达量的测定30-31
• 2.2.14 cyp-35A4和cyp-35B3基因沉默线虫的培养31
• 2.2.15 3-溴丙酮酸作用于cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4和cyp-35B3基因沉默或突变株线虫31
• 2.2.16 数据分析31-32
• 第三章 结果32-44
• 3.1 3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫毒性作用观察32-35
• 3.1.1 3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫毒性作用的形态观察32
• 3.1.2 3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫急性毒性实验结果32
• 3.1.3 3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫发育的影响32-33
• 3.1.4 3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫后细胞凋亡染色结果33-34
• 3.1.5 3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫后脂肪染色结果34-35
• 3.2 3-溴丙酮酸处理秀丽隐杆线虫后己糖激酶基因的表达35-41
• 3.2.1 3-溴丙酮酸作用线虫后总RNA的提取35
• 3.2.2 hxk-1、hxk-2 和hxk-3 实时荧光定量PCR结果35-36
• 3.2.3 目的基因hxk-1、hxk-2 和hxk-3 克隆结果36-39
• 3.2.4 hxk-1、hxk-2 和hxk-3 基因RNA干扰效果验证39
• 3.2.5 3-溴丙酮酸对hxk基因RNA干扰线虫的毒力结果39-40
• 3.2.6 己糖激酶基因遗传进化分析结果40-41
• 3.3 秀丽隐杆线虫cyp-35 家族基因对 3-溴丙酮酸代谢的研究41-44
• 3.3.1 cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5、cyp-35B3和cyp-35C1的实时荧光定量PCR结果41-43
• 3.3.2 3-溴丙酮酸对不同基因RNA干扰线虫或突变株线虫的毒力结果43-44
• 第四章 讨论44-48
• 4.1 3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫幼虫发育的影响44
• 4.2 3-溴丙酮酸对秀丽隐杆线虫毒性机制的探讨44-45
• 4.3 cyp-35 家族基因在秀丽隐杆线虫药物代谢机制中的作用45-48
• 第五章 结论48-49
• 5.1 主要结论48
• 5.2 研究展望48-49
• 参考文献49-53
• 在学期间的研究成果53-54
• 附录一 英语缩略词汇表54-55
• 致谢55

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