HER2抑制剂TAK165协同全反式维甲酸诱导人急性髓系白血病细胞分化的药效及其机制研究

发布时间：2017-05-31 01:00

  本文关键词：HER2抑制剂TAK165协同全反式维甲酸诱导人急性髓系白血病细胞分化的药效及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的：急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是一种血液系统肿瘤,严重威胁人类生命健康。AML的重要标志是存在严重的髓系分化障碍。所以,目前认为可以将诱导分化治疗作为临床治疗AML的一种有效的治疗策略。全反式维甲酸(All-transretinoic acid,ATRA)是第一个成功用于临床治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL, AML型M3)的分化诱导剂。然而,APL患者在大量使用ATRA时会出现全反式维甲酸耐药、复发等现象,同时还会产生不同程度的不良反应。此外,ATRA除了对APL患者有较好的疗效,对于AML的其他亚型,都没有显著的治疗效果。因此,寻找更为高效低毒的诱导分化药物或采用药物联合方案完善维甲酸诱导分化治疗策略是解决上述问题的关键途径。人表皮生长因子受体2(HER2)是ErbB家族中的重要成员,参与细胞生长,增殖,粘附和分化等重要生命过程的调控。有文献报道,抑制HER2的信号通路对白血病可能有潜在的治疗作用。TAK165 (Mubritinib)是一种HER2的特异抑制剂,其应用于肿瘤的治疗目前仍处于临床研究阶段。有文献报道,TAK165可以通过介导细胞凋亡,进而针对包括AML在内的多种肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。但是,关于TAK165调控ATRA介导的AML细胞分化目前尚没有文献报道。因此,本课题拟通过实验研究HER2抑制剂TAK165 (Mubritinib)与ATRA联合应用,诱导AML细胞的分化效应,并进一步探讨其内在的分子机制。研究方法：选用人白血病细胞株HL60和NB4为主要研究对象,考察TAK165对于AML细胞的增殖以及周期分布的影响,并检测TAK165与ATRA合用对于AML细胞的诱导分化作用。采用台盼蓝拒染法结合血细胞计数板计数检测细胞增殖情况,描绘细胞生长曲线和存活率曲线；细胞经碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色结合流式细胞术检测了细胞周期分布的变化情况；应用Western blot检测细胞周期相关蛋白和分化相关蛋白(c-Myc、p21、p27、C/EBPβ、PU.1)的表达；细胞经CD11b-PE抗体孵育后通过流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb的表达；应用硝基四氮唑蓝(NBT)还原法检测细胞分化能力；应用瑞氏-吉姆萨染色法检测细胞形态学变化；应用Real-time PCR检测细胞内分化相关因子(PU.1, C/EBPB、C/EBPE)的mRNA表达水平；选用人白血病细胞株HL60和NB4为主要研究对象,考察TAK165和ATRA诱导AML细胞分化的分子机制。细胞经CD11b-PE抗体孵育后通过流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb的表达；应用硝基四氮唑蓝(NBT)还原法检测细胞分化能力；应用Real-time PCR检测细胞内RARB、PXN的mRNA表达水平；应用Western blot检测HER2,RARa蛋白表达水平,检测分化启动因子STAT1表达及活化水平(STAT1、p-STAT1 S727), MAPK家族蛋白表达以及活化水平(MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK);利用HER2单克隆抗体药物赫赛汀研究HER2靶点在TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化中的作用。用携带pCCL-RARa的慢病毒载体转染HL60R细胞,通过过表达RARa检测其在TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化过程中的作用。用携带shRNA-STAT1的慢病毒载体转染NB4细胞,通过沉默STAT1检测其在TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化过程中的作用。选用MEK/ERK特异性抑制剂PD98059和U0126、p38特异抑制剂SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125,研究MAPK信号通路在TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化过程中的作用。研究结果：1)TAK165引起AML细胞增殖抑制、周期阻滞,而不会引起明显的细胞死亡。TAK165作用于HL60和NB4细胞,通过台盼蓝拒染法结合血细胞计数板计数,结果显示TAK165会引起细胞增殖抑制,而且抑制程度呈剂量依赖性和浓度依赖性,但是不会引起明显的细胞死亡。通过PI单染结合流式细胞术检测细胞周期分布的变化,结果显示TAK165能够使HL60和NB4细胞周期阻滞于G0/G1期。Western blot检测周期相关蛋白(c-Myc、p21、p27)的表达变化,显示TAK165作用于HL60和NB4细胞, c-Myc蛋白表达下调,p21、p27表达上调,确证了TAK165可以使HL60和NB4细胞发生周期阻滞。2)TAK165协同ATRA诱导AML细胞分化。TAK165与ATRA联合作用于HL60和NB4细胞,通过血细胞计数板计数法,计数并描绘细胞生长曲线,结果表明TAK165可以明显促进ATRA引起的HL60和NB4细胞的增殖抑制作用。通过PI染色法检测细胞周期分布变化,TAK165可以协同ATRA使HL60和NB4细胞周期阻滞于G0/G1期。我们从分子标志、生化功能、形态学和细胞分化相关基因和蛋白的表达情况几方面确证了TAK165可以增强ATRA引起HL60和NB4细胞分化的作用。ATRA单独作用于HL60和NB4细胞72小时,CD11b阳性率分别为24.8%±3.0%,而TAK165与ATRA联合应用时,CD11b阳性率达到80.0±3.4%。TAK165与ATRA联合作用时,NBT还原能力也较TAK165和ATRA单独作用时明显增强,NBT阳性细胞比例由21.30%±2.45%到93.40%±1.19%。瑞氏-吉姆萨染色结果显示,TAK165与ATRA作用于HL60和NB4细胞,引起细胞胞体变小,细胞核固缩,核质比例下降,而且TAK165与ATRA合用引起的细胞形态学变化与单用组相比更为明显。此外,通过Realtime-PCR和Western blot检测细胞分化相关基因(CEBPB、CEBPE、PU.1),分化相关蛋白(C/EBPp、PU.1)的表达情况,发现TAK165与ATRA联合作用使分化相关基因上调,相关蛋白的表达增加,确证了TAK165可以协同ATRA诱导AML细胞分化。3)TAK165协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究。通过Western blot检测HL60和NB4细胞中HER2蛋白表达,结果显示与HER2高表达的乳腺癌BT474相比,在AML细胞中几乎检测不到HER2蛋白的表达。加入HER2单克隆抗体药物赫赛汀后,PI染色检测周期分布结果显示,赫赛汀既不能协同ATRA引起细胞周期阻滞,也不会对TAK165和ATRA引起的G0/G1周期阻滞有明显的促进作用。与之相对应的,加入赫赛汀后,CDllb阳性细胞比率也没有明显变化。以上结果说明,TAK165并不是通过抑制HER2来促进ATRA诱导AML细胞分化。RT-PCR检测细胞内RARa靶基因表达的结果显示,与TAK165和ATRA协同诱导分化效应一致,在HL60和NB4细胞中,RARB和PXN在TAK165与ATRA联合作用时均发生明显协同上调。而在RARα突变的HL60R细胞中,给药后RARB和PXN的转录水平没有明显变化。同时,TAK165与ATRA也不会引起HL60R细胞分化,CD11b阳性率由3.05±0.35%到10.98±0.10%。当在HL60R细胞中过表达RARa后,与对照组相比,细胞内RARB和PXN基因水平发生了明显上调,同时CDllb阳性率也从35.33±0.25%增强至67.02±4.94%。以上结果说明,RARa的激活参与了TAK165协同ATRA诱导AML细胞分化的过程。Western blot结果显示,TAK165与ATRA作用于NB4细胞,协同上调了STAT1蛋白S727位点磷酸化水平。慢病毒介导的shRNA-STAT1显著下调了NB4细胞中STAT1蛋白的表达水平。通过NBT还原实验以及CD11b的检测,结果显示STATl的敲除使TAK165对ATRA诱导细胞分化的协同作用发生了逆转。以上结果显示,STAT1的激活在TAK165与ATRA协同诱导分化的过程中发挥了关键作用。Western blot检测结果表明,TAK165与ATRA联合作用于HL60和NB4细胞时,可以激活MEK/ERK信号通路,p-MEK、p-ERK蛋白水平均会协同上调,而其相应原型蛋白水平不变。然而JNK和p38信号通路在这一过程中不会被激活,蛋白水平以及磷酸化水平均不变。JNK特异性抑制剂sp600125和p38特异性抑制剂SB203580对于TAK165和ATRA协同诱导分化效应影响不大。但是加入MEK特异性抑制剂PD98059,U0126后,TAK165与ATRA合用组细胞分化水平有明显的下降,CDllb阳性率从82.37%±0.37%到56.22±0.68%,36.5%±2.88%。此外,Western bolt结果显示,PD98059和U0126作用与NB4细胞后,会明显抑制TAK165和ATRA合用引起的STAT1蛋白发生磷酸化激活。以上结果说明,MEK/ERK信号通路通过调控了STAT1的活性,进而影响了TAK165和ATRA协同诱导分化过程。结论：本论文较为系统地讨论了TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化效应,并对其分子机制进行了初步探讨。研究表明,TAK165可以通过激活MEK/ERK信号通路,调控RARa/STAT1轴的激活,进而促进ATRA对于HL60和NB4细胞的诱导分化效应。本研究首次提出TAK165与ATRA协同可诱导AML细胞分化,为临床上髓性白血病的治疗提供了一种崭新的基于诱导分化的联合治疗策略。
【关键词】：TAK165(Mubritinib) 全反式维甲酸(ATRA) 急性髓系白血病(AML) 细胞分化 RARα
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-10
• ABSTRACT10-17
• 1 引言17-19
• 2 实验材料与仪器19-23
• 2.1 细胞株和质粒19
• 2.2 药物与主要试剂19-22
• 2.3 仪器22-23
• 3 实验方法23-30
• 3.1 细胞培养23
• 3.2 台盼蓝拒染法检测HL60和NB4细胞生长率、存活率23
• 3.3 流式细胞术检测HL60和NB4细胞周期分布23
• 3.4 流式细胞术检测HL60和NB4细胞表面分化抗原CD11b表达23-24
• 3.5 NBT细胞还原能力检测24
• 3.6 瑞氏-吉姆萨染色观察HL60和NB4细胞核形态变化24-25
• 3.7 Western Blotting检测相关蛋白25-26
• 3.8 Realtime-PCR测定细胞相关基因表达水平的变化26-28
• 3.9 慢病毒转染细胞28
• 3.10 分离制备胞浆蛋白、核蛋白样本28-29
• 3.11 数据分析29-30
• 4 实验结果30-62
• 4.1 TAK165可以抑制AML细胞增殖30-31
• 4.2 TAK165诱导AML细胞周期阻滞31-33
• 4.3 TAK165可以协同ATRA抑制AML细胞增殖33-34
• 4.4 TAK165协同ATRA诱导AML细胞周期阻滞34-35
• 4.5 TAK165协同ATRA诱导AML细胞髓性分化35-41
• 4.6 人类表皮生长因子受体2(HER2)对TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化的影响41-46
• 4.7 RARα的激活对于TAK165与ATRA协同诱导AML细胞分化的影响46-52
• 4.8 STAT1的激活在TAK165协同ATRA诱导AML细胞分化的过程中,发挥关键作用52-56
• 4.9 TAK165与ATRA联合作用对于MAPK信号通路活性的影响56-62
• 5 讨论62-65
• 参考文献65-69
• 综述 基于全反式维甲酸作用机制的白血病合用治疗策略69-85
• 参考文献78-85
• 作者简介及硕士期间科研成果85-86

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本文编号：408264