重组人p66Shc腺病毒和赖氨藤黄酸盐对肿瘤细胞的抑制作用及机制

发布时间：2017-06-09 18:11

  本文关键词：重组人p66Shc腺病毒和赖氨藤黄酸盐对肿瘤细胞的抑制作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分重组人p66Shc腺病毒对HeLa细胞和MCF-7细胞增殖的抑制作用目的：p66Shc是调节哺乳动物体内活性氧水平、诱导细胞凋亡以及与寿命相关的多功能基因。近年来,其对肿瘤细胞的作用也引起了研究者的注意,但是关于p66Shc对肿瘤细胞的作用结果仍有争议。为了深入研究p66Shc蛋白对肿瘤的生物效应,我们将前期构建的重组人p66Shc腺病毒(AdenoX-p66Shc)表达载体分别感染HeLa细胞和MCF-7细胞,观察p66Shc高表达对细胞增殖的作用及机制。方法：MTT检测AdenoX-p66Shc对HeLa细胞和MCF-7细胞活力的影响,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为正常对照组细胞；DCFH-DA荧光探针检测ROS水平；ELISA检测细胞8-OHdG的含量；Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化；流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布；Western blot检测细胞相关蛋白的表达情况。结果：1.感染AdenoX-p66Shc后,HeLa细胞和MCF-7细胞的增殖活性均受到明显抑制。但是HUVECs细胞的增殖并未受到抑制。2. HeLa细胞和MCF-7细胞的活性氧水平显著升高,伴随着DNA氧化损伤产物8-OHdG含量的增加。3.各组HeLa细胞的细胞核形态正常,染色质均匀；细胞凋亡率的结果显示,HeLa细胞和MCF-7细胞的凋亡率均无明显变化。4.流式细胞周期检测结果显示,HeLa细胞和MCF-7细胞的G2/M期比例显著升高,G1期比例显著下降。5.感染AdenoX-p66Shc后,HeLa细胞和MCF-7细胞的p66Shc表达水平均有明显升高,同时p53蛋白表达水平和p-p53水平也有显著升高。凋亡相关蛋白Bax、 Bcl-2、Caspase-3的表达水平均无显著变化；而G2/M期相关蛋白CyclinB1和CDK1表达水平则明显升高。结论：感染AdenoX-p66Shc可以抑制HeLa细胞和MCF-7细胞增殖,但对正常细胞没有抑制作用。AdenoX-p66Shc感染引起的p66Shc蛋白表达水平升高可导致活性氧水平增高,引起DNA损伤,诱导p53蛋白表达,使细胞发生G2/M期阻滞,从而抑制肿瘤细胞的增殖。第二部分赖氨藤黄酸盐体外抗肿瘤活性及机制研究目的：藤黄酸是藤黄的主要活性成分,已有的研究表明,藤黄酸具有明显的抗肿瘤作用。藤黄酸在醇类、酮类等有机溶剂中溶解度较大,但是在水中溶解度很小,很大程度限制了其在肿瘤治疗方面的应用。本研究中,我们采用本室自制的水溶性的赖氨藤黄酸盐(GAL),研究GAL的抗肿瘤活性,并对其机制进行了探讨。方法：采用质谱分析检测GAL信号峰；MTT方法检测GAL对MCF-7细胞存活力率的影响；DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧水平的变化；Hoechst 33342染色观察细胞核形态变化；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；Western Blot法检测相关蛋白表达。结果：1.质谱分析结果在荷质比(m/z)为775.4处有一特征强信号峰。藤黄酸和赖氨酸经离子键结合形成的GAL的相对分子量理论值为775,说明该信号峰为GAL的信号峰。2.GAL对MCF-7细胞的存活率有抑制作用,并且随着GAL浓度的增大,处理时间的延长,MCF-7细胞的存活率不断下降。GAL对MCF-7细胞的抑制作用与GA相当。同时加入NAC后,MCF-7细胞活力有所逆转,NAC能够阻断GAL对MCF-7细胞的抑制作用。3.GAL处理MCF-7细胞后,细胞内的活性氧水平随GAL浓度的增加而升高,加入NAC后可以使升高的活性氧水平有所降低。4.MCF-7细胞经GAL处理24 h后,大多数细胞发生典型的凋亡形态学改变,如染色质凝聚,细胞皱缩以及凋亡小体的形成。Annexin V/PI-FITC双染结果进一步证实GAL引起MCF-7细胞凋亡,并且凋亡率随GAL浓度升高而增加。5. Western Blot结果显示GAL降低SIRT1的表达,同时升高FOXO-3a的磷酸化水平和p27Kip1的表达水平。此外GAL还可促进Cleaved-Caspase-3的表达。结论：GAL具有与GA同样的抑制MCF-7细胞增殖效果。GAL升高MCF-7细胞内的活性氧水平,并且通过SIRT1/FOXO3a/p27Kip1信号通路和Caspase-3信号通路诱导细胞发生凋亡,从而抑制MCF-7细胞的增殖。
【关键词】：p66Shc 活性氧 HeLa MCF-7 增殖 赖氨藤黄酸盐 SIRT1 活性氧 MCF-7 N-乙酰半胱氨酸
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 第一章 前言11-19
• 1. p66Shc的结构及功能11-12
• 2.p66Shc的分布及定位12
• 3.p66Shc与氧化应激12-14
• 4.p66Shc与细胞凋亡14-15
• 5.p66Shc与p53的相互作用15-16
• 参考文献16-19
• 第二章 重组人p66Shc腺病毒对HeLa细胞和MCF-7细胞增殖的抑制作用19-53
• 前言19-20
• 材料与方法20-32
• 结果32-45
• 讨论45-48
• 结论48
• 参考文献48-53
• 第三章 赖氨藤黄酸盐体外抗肿瘤活性及分子机制研究53-71
• 前言53-54
• 材料与方法54-55
• 结果55-64
• 讨论64-66
• 结论66
• 参考文献66-71
• 第四章 全文总结71-72
• 文章发表情况72
• 个人简介72-73
• 致谢73

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 季宇彬;高鹏;邹翔;;G_2/M检验点调控机制研究概述[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年

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本文编号：436267