Claviceps paspali菌的选育及多态性分析

发布时间：2017-06-14 06:09

  本文关键词：Claviceps paspali菌的选育及多态性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：麦角科的麦角菌属真菌是麦角碱的主要生产者,Claviceps paspali是其中重要的一类麦角菌,其主要代谢产物是麦角酰胺类生物碱。鉴于麦角碱在毒理学和药理学等方面的重要作用,目前广泛应用于现代医药。麦角碱与血清素、多巴胺受体和肾上腺素受体一起作用于中枢神经系统,主要用于治疗产后出血、抗高血压、帕金森症和抑制垂体激素分泌等。目前,国内的麦角资源较少,同时麦角菌种的严重退化等问题导致无法大规模发酵麦角菌获得麦角碱,因而麦角碱类药物的来源依然依赖于进口。本课题以实验室保藏的Claviceps paspali为材料进行筛选和选育。建立了Claviceps paspali的高通量筛选法,通过24孔板高通量筛选法和摇瓶筛选法筛选到了一株产碱量较高且产碱较稳定的菌株C6,菌株产碱量为101.33 μg/mL。本研究以C6菌株为出发菌株进行化学诱变育种,诱变剂选取吖啶橙、硫酸二甲酯和MNNG,诱变育种后各挑选120株菌株进行24孔板高通量筛选。其中MNNG诱变育种筛选到一株产孢菌株C6-28,且该菌株传代稳定性较好,与C6菌株相比产碱量提高了约50%。对C6-28菌株进行种子和发酵条件考察,并尝试采用Plackttt-Burman实验对发酵培养基进行条件优化。研究确定了最适种子生长时间、孢子接种量、种子接种量和发酵时间,同时确定M培养基为种子培养基,M2培养基为发酵培养基。本研究以产孢的C6-28菌株为材料,诱变材料为该菌株的孢子,对孢子进行计数从而达到定量诱变效果。经过四次MNNG诱变育种,筛选到高产菌株B3-24,菌株产碱量为815.5μg/mL,与出发菌株C6相比产碱量提高约8倍。该菌株菌丝体粗壮,分节明显,多为串珠状菌丝,这与高产菌株的显微形态描述相一致。研究结果表明用MNNG 对 Claviceps paspali菌株的孢子进行诱变育种效果较好。F33菌株的诱变育种,筛选出5种不同形态的诱变菌株,采用改进的氯化苄法提取这六种不同形态菌株的DNA。利用RAPD技术对六种不同形态的菌株进行多态性分析,根据RAPD扩增结果构建菌株的聚类分析树状图,从基因水平进一步研究各菌株之间的差异性。
【关键词】：Claviceps paspali 高通量筛选 诱变育种 条件考察 多态性分析
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要6-7
• abstract7-13
• 第1章 绪论13-36
• 1.1 研究背景13-15
• 1.2 麦角碱简介15-21
• 1.2.1 麦角碱的分布和结构15-19
• 1.2.2 麦角碱的生物活性19-21
• 1.3 不同真菌中麦角碱的生物合成途径21-29
• 1.3.1 麦角碱四环麦角灵环的生物合成21-24
• 1.3.2 麦角碱的生物合成分支途径24-29
• 1.4 菌种选育方法29-31
• 1.4.1 自然选育29
• 1.4.2 诱变育种29-31
• 1.5 状真菌遗传操作31-32
• 1.5.1 遗传操作简介31
• 1.5.2 高通量筛选方法31-32
• 1.6 RAPD技术在真菌分类鉴定上的应用32-34
• 1.6.1 RAPD技术简介32-33
• 1.6.2 RAPD技术应用33-34
• 1.7 论文设计思想及主要内容34-36
• 1.7.1 论文设计思想34-35
• 1.7.2 论文主要内容35-36
• 第2章 雀稗麦角菌高通量筛选方法的建立36-46
• 2.1 实验材料36-37
• 2.1.1 实验菌株36
• 2.1.2 实验仪器36
• 2.1.3 实验试剂36-37
• 2.1.4 培养基37
• 2.2 实验方法37-40
• 2.2.1 菌株的传代和保存37-38
• 2.2.2 麦角碱含量测定方法38-39
• 2.2.3 高通量筛选方法39
• 2.2.4 摇瓶筛选法39-40
• 2.2.5 高产菌株传代稳定性考察40
• 2.3 实验结果40-44
• 2.3.1 菌株的形态特征40-41
• 2.3.2 标准曲线的建立41
• 2.3.3 高通量筛选结果41-43
• 2.3.4 摇瓶筛选结果43-44
• 2.3.5 高产菌株传代稳定性考察结果44
• 2.4 小结与讨论44-46
• 第3章 C6菌株的诱变育种46-58
• 3.1 实验材料46-47
• 3.1.1 实验菌株46
• 3.1.2 实验仪器46
• 3.1.3 实验试剂46
• 3.1.4 培养基46-47
• 3.2 实验方法47-51
• 3.2.1 吖啶橙诱变育种47-48
• 3.2.2 硫酸二甲酯诱变育种48-49
• 3.2.3 MNNG诱变育种49-51
• 3.2.4 高产诱变菌株稳定性考察51
• 3.3 实验结果51-56
• 3.3.1 吖啶橙诱变育种结果51-53
• 3.3.2 硫酸二甲酯诱变育种结果53-54
• 3.3.3 MNNG诱变育种结果54-55
• 3.3.4 高产诱变菌株稳定性考察结果55-56
• 3.4 小结与讨论56-58
• 第4章 高产菌株的条件考察58-72
• 4.1 实验材料58-59
• 4.1.1 实验菌株58
• 4.1.2 实验仪器58
• 4.1.3 实验试剂58
• 4.1.4 培养基58-59
• 4.2 实验方法59-64
• 4.2.1 种子条件考察59-61
• 4.2.2 发酵条件考察61-64
• 4.3 实验结果64-70
• 4.3.1 种子条件考察结果64-66
• 4.3.2 发酵条件考察结果66-70
• 4.4 小结与讨论70-72
• 第5章 C6-28菌株的孢子诱变育种72-82
• 5.1 实验材料72-73
• 5.1.1 实验菌株72
• 5.1.2 实验仪器72
• 5.1.3 实验试剂72
• 5.1.4 培养基72-73
• 5.2 实验方法73-76
• 5.2.1 孢子的第一次诱变育种73-74
• 5.2.2 孢子的第二次诱变育种74
• 5.2.3 孢子的第三次诱变育种74-75
• 5.2.4 孢子的第四次诱变育种75-76
• 5.2.5 高产诱变菌株传代稳定性考察76
• 5.3 实验结果76-81
• 5.3.1 孢子的第一次诱变育种结果76-77
• 5.3.2 孢子的第二次诱变育种结果77-78
• 5.3.3 孢子的第三次诱变育种结果78-79
• 5.3.4 孢子的第四次诱变育种结果79-80
• 5.3.5 高产诱变菌株传代稳定性考察结果80-81
• 5.4 小结与讨论81-82
• 第6章 不同形态Claviceps paspali的多态性分析82-96
• 6.1 实验材料82-83
• 6.1.1 实验菌株82
• 6.1.2 实验仪器82
• 6.1.3 实验试剂82-83
• 6.1.4 培养基83
• 6.2 实验方法83-88
• 6.2.1 不同形态菌株的产碱量测定83
• 6.2.2 菌株基因组DNA的提取83-86
• 6.2.3 RAPD引物筛选86
• 6.2.4 RAPD扩增体系优化86-87
• 6.2.5 RAPD扩增程序优化87
• 6.2.6 RAPD扩增产物电泳分析87
• 6.2.7 RAPD扩增产物数据分析87-88
• 6.3 实验结果88-94
• 6.3.1 不同形态菌株的产碱量测定结果88
• 6.3.2 菌株基因组DNA的提取结果88-89
• 6.3.3 RAPD引物筛选结果89
• 6.3.4 RAPD扩增体系优化结果89-90
• 6.3.5 RAPD扩增程序优化结果90
• 6.3.6 RAPD扩增产物电泳分析结果90-92
• 6.3.7 RAPD扩增产物数据分析结果92-94
• 6.4 小结与讨论94-96
• 结论96-98
• 致谢98-99
• 参考文献99-106
• 附录106-110
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果110

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