栀子与乌头对关节炎大鼠药理活性及西红花酸脂质体制备研究

发布时间：2020-03-19 11:39

【摘要】：目的:研究栀子与两种乌头对佐剂性关节炎大鼠药理活性以及西红花酸脂质体制备。方法:1.栀子中总环烯醚萜苷及总西红花苷对佐剂性关节炎(AA)大鼠保护作用研究以HPD_(100)大孔吸附树脂分离栀子(Gardenia jasminoides Ellis)中总环烯醚萜苷(TIG)和总西红花苷(TC)部位,采用UHPLC-DAD-QTOF-MS测定这两个部位主要成分及其含量,并通过紫外可见分光光度法(UV-Vis)测定TIG和TC中总环烯醚萜苷和总西红花苷的含量。通过AA大鼠模型研究TIG和TC抗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)作用及机制。将雄性SD大鼠30只分为5组:空白组(control)、模型组(AA)、TIG组(160 mg/kg/d)、TC组(160 mg/kg/d)、DS组(5 mg/kg/d),每组6只。于大鼠右足趾底部注射0.1 m L弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,FCA)造模,给药14天后,拍照观察大鼠右足趾底部肿胀度,电子游标卡尺测量大鼠踝关节直径,以X-ray检测大鼠踝关节状态,HE染色检测大鼠踝关节、脾脏、胸腺病理变化,采用免疫组化染色检测踝关节滑膜肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达。2.西红花酸脂质体制备与单因素考察将西红花苷水解为西红花酸,采用UHPLC-DAD-QTOF-MS鉴定化合物结构,并测定西红花酸含量。薄膜分散结合超声法制备西红花酸脂质体,激光粒度仪测定粒径、粒径分布和zeta电位,UV-Vis测定包封率(EE%)和载药量(DL%)。通过单因素设计优化西红花酸脂质体制备条件,考察超声时间、水合时间、水合温度、大豆卵磷脂与胆固醇比例、大豆卵磷脂与西红花酸比例对脂质体平均粒径、EE%和DL%的影响,以及十八胺用量对脂质体表面电位、平均粒径、EE%、DL%的影响。3.玉龙乌头和黄草乌对佐剂性关节炎大鼠保护作用研究以酸提碱沉法和甲醇超声法分别制备玉龙乌头(Aconitum stapfianum Hand-Mazz.)和黄草乌(Aconitum vilmorinianum Kom.)有效部位。急性毒性研究得出玉龙乌头总碱(total alkaloids of Aconitum stapfianum Hand-Mazz.,TAA)和黄草乌甲醇提取物(methanol extract of Aconitum vilmorinianum Kom.,MEA)的口服半数致死量(LD_(50))。按药理方法计算TAA和MEA的有效剂量,然后通过AA大鼠模型研究两种乌头抗RA作用及机制。将36只雄性SD大鼠随机分为6组:空白组(control)、模型组(AA)、TAA低剂量组(1.5 mg/kg/d)、TAA高剂量组(3.0 mg/kg/d)、MEA低剂量组(5 mg/kg/d)、MEA高剂量组(10 mg/kg/d),每组6只。于大鼠右足趾底部注射0.1mL FCA造模,电子游标卡尺测量大鼠踝关节直径,X-ray检测大鼠踝关节状态,HE染色检测大鼠踝关节、脾脏、胸腺的病理变化,免疫组化染色检测踝关节滑膜中TNF-α、TGF-β1表达。结果:1.栀子中总环烯醚萜苷及总西红花苷对佐剂性关节炎(AA)大鼠保护作用研究测定结果显示,栀子TIG中栀子苷含量为53.6%,TIG中西红花苷-1、西红花苷-2和西红花苷-3含量分别为37.2%、3.3%和4.6%。UV-Vis测定TIG中总环烯醚萜含量为58.2%,TC中总西红花苷含量为54.7%。在AA大鼠药理研究中,与模型组相比,大鼠踝关节直径变化和X-ray检测结果显示,TIG(160 mg/kg/d)显著降低AA大鼠踝关节直径(P(27)0.05),缓解踝关节软组织肿胀和骨质损伤(P(27)0.05);组织病理学检查结果显示,TIG(160 mg/kg/d)明显缓解大鼠踝关节炎症细胞浸润,滑膜衬里层细胞增生等病理变化(P(27)0.01),并减轻脾脏和胸腺充血肿胀;免疫组化结果显示,TIG(160mg/kg/d)显著减少大鼠滑膜中TNF-α和TGF-β1表达(P(27)0.01)。TC(160 mg/kg/d)给药也可缓解上述病理变化,但是在X-ray检测评分和TGF-β1蛋白表达指标中,TC组与模型组比较没有显著性差异(P0.05)。2.西红花酸脂质体制备与单因素考察UHPLC-DAD-QTOF-MS测定西红花酸含量为73.67%,薄膜分散结合超声法制备西红花酸脂质体平均粒径为240±8.6 nm、PDI值0.216±0.03、zeta电位为+24.1±3.3 mv、EE%为95.5±3.2%、DL%为26.1±1.2%。西红花酸脂质体最优制备条件:十八胺用量为40mg/100mL、超声时间为40 min、水合时间2 h左右、水合温度40℃、大豆卵磷脂与胆固醇比例为6:1、大豆卵磷脂与西红花酸比例为6:1。3.玉龙乌头和黄草乌对佐剂性关节炎大鼠保护作用研究TAA的口服LD_(50)是43.002 mg/kg,MEA的口服LD_(50)是150.960 mg/kg;根据计算确定TAA的给药剂量为1.5 mg/kg/d、3.0 mg/kg/d;MEA的给药剂量为5 mg/kg/d、10 mg/kg/d。在AA大鼠药理研究中,与模型组相比,MEA(5、10 mg/kg/d)给药均显著降低AA大鼠踝关节直径(P(27)0.05,P(27)0.01);踝关节X-ray摄片和评分显示,MEA(5、10 mg/kg/d)给药均明显缓解AA大鼠关节软组织肿胀,骨质损伤(P(27)0.01);踝关节HE染色结果和病理评分显示,MEA(5、10 mg/kg/d)给药均明显改善AA大鼠踝关节各种病理变化(P(27)0.01);脾脏和胸腺HE染色结果显示,MEA(5、10 mg/kg/d)给药均明显改善AA大鼠脾脏和胸腺充血肿胀;免疫组化结果显示,MEA(5、10 mg/kg/d)给药均显著降低滑膜TNF-α和TGF-β1表达(P(27)0.01)。TAA(1.5 mg/kg/d)给药也可改善上述病理变化,但各指标均没有显著性差异(P0.05)。TAA(3.0 mg/kg/d)给药显著降低大鼠踝关节直径(P(27)0.05),并缓解上述病理变化(P(27)0.01)。结论:1.研究首次阐明栀子中总环烯醚萜苷和总西红花苷对AA关节炎大鼠均有保护作用,但总环烯醚萜苷的药效更加显著。考虑到栀子中总环烯醚萜苷(栀子苷)的含量更高,今后应采用总环烯醚萜苷(栀子苷)含量测定作为栀子抗炎药效评价指标。2.首次采用薄膜水化结合超声法制备西红花酸脂质体,该脂质体具有平均粒径小、PDI值低、EE%和DL%高等优势。并且通过单因素设计优化西红花酸脂质体制备条件,确定西红花酸脂质制备的十八胺用量、超声时间、水合时间、水合温度、大豆卵磷脂与胆固醇比例、大豆卵磷脂与西红花酸比例。3.首次探索研究黄草乌和玉龙乌头毒理,确定这两种乌头的口服LD_(50),并阐明黄草乌和玉龙乌头对AA关节炎大鼠均有保护作用,均是药效显著的抗RA中药。
【图文】：

栀子苷,化学结构,西红花

图 1 栀子苷和西红花苷的化学结构Fig.1 Structures of geniposide and crocins如上所述，栀子中除环烯醚萜苷(栀子苷)外，另一类含量较高的化合物为西红花rocin)，西红花苷属天然类胡萝卜素，这类化合物是由西红花酸和葡萄糖或龙胆构成的一系列糖酯类化合物，主要由西红花苷-1(crocin-1)、西红花苷-2(crocin-2)花苷-3(crocin-3)和西红花苷-4(crocin-4)等母核相同的化合物组成(图 1)。西红花苷是天然食用色素，而且具有显著抗炎药理活性。Yang 等[25]研究显示，西红花苷善失血性休克(HS)患者炎症驱动带来的组织损伤，在 HS 手术大鼠中，西红花苷著降低血清中促炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-6 水平，增加抗炎性细胞因子 IL-1。Yosri 等[26]研究显示，西红花苷能调节 IL-4/IL-13 信号传导来抑制炎症，并改鼠变应性气道哮喘。此外，还有研究显示，crocin 能抑制体外 IL-1β 诱导的关节细胞 MMPS 活化，而且在体内兔关节炎模型中抑制软骨炎症浸润[27]。以上数据，西红花苷具有明显抗炎作用，也可能是栀子和西红花中主要抗炎活性成分之一

光谱图,图谱,环烯醚萜苷,栀子苷

图 1 TIG 和 TC 的 LC-MS 图谱Fig.1 LC-MS chromatograms of TIG and TC3.2 UV-Vis 测定由图 1 中可以看出，除了这四种成分外，还有与栀子苷和西红花苷色谱峰类似的其它小色谱峰，光谱图与主成分峰类似，显示 TIG 中除栀子苷外还有其它环烯醚萜苷衍生物，TC 中除了 crocin-1、crocin-2、crocin-3 外还有其它西红花苷衍生物。因此，为进一步反映 TIG 和 TC 中总苷的含量，本研究同时采用 UV-Vis 测定两个部位总苷含量。UV-Vis 虽然不能具体分离检测 TIG 和 TC 中各单体成分，，但在分析中分别使用栀子苷和西红花苷-1 对照品即可分别测定出两个部位中总环烯醚萜苷和总西红花苷含量。本课题以对照品栀子苷和 crocin-1 为参照，用紫外可见分光光度计测定 TIG和 TC 中总环烯醚萜苷和总西红花苷含量(图 2)，分别在 238 nm 和 440 nm 处测定 TIG和 TC 的吸光度 A 值，计算出 TIG 中总环烯醚萜苷的含量为 58.2%，TC 中总西红花
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】