白花丹素调节胰腺癌及MDSCs分化的作用机制研究

发布时间：2020-03-20 00:43

【摘要】：背景与目的白花丹素(Plumbagin,5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinone;PLB)是一种天然萘醌,于药用植物白花丹的根部提取。体内外研究表明白花丹素具有强大的抗肿瘤、抗炎、止痛以及抗菌活性,白花丹素通过多种机制发挥抗肿瘤活性,包括介导细胞凋亡和自噬,介导细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞迁移和侵袭以及抑制血管生成。但是关于白花丹素在肿瘤免疫微环境方面的调节作用还没有相关报道。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞产生的各种细胞因子有利于免疫抑制性细胞的募集,可以抑制机体的免疫应答,使得肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的攻击。髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)在促进免疫耐受和疾病发展方面发挥重要作用,是介导肿瘤免疫逃逸的重要细胞。本论文利用体内外实验研究白花丹素是否可以直接调节MDSCs的分化和功能,进而调节肿瘤微环境尤其是对免疫抑制性细胞MDSCs的调节作用,从而抑制胰腺癌的发展,并研究介导此调节作用的相关分子机制。方法我们利用人外周血单个核细胞(PBMC)诱导分化模型研究不同浓度的白花丹素对髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)分化及功能的影响。然后,通过体内实验在C57BL/6小鼠胰腺原位上接种小鼠胰腺癌细胞(Panc02)来构建小鼠胰腺癌模型,腹腔给予白花丹素治疗后,根据肿瘤的体积和重量以及产生的腹水体积评估白花丹素的抗瘤活性。利用流式细胞g.检测小鼠脾脏、骨髓和肿瘤组织中浸润的免疫细胞亚群(CD4~+T、CD8~+T、NKT、γδT)的比例以及髓系来源的免疫抑制性细胞(MDSCs)比例来探究白花丹素对小鼠肿瘤免疫微环境的调节作用。利用流式细胞g.,RT-PCR以及Transwell等技术研究分析白花丹素对MDSCs表面标记物,相关炎性细胞因子的表达以及MDSCs向肿瘤细胞迁移能力的影响。因为在MDSCs活化和分化的过程中,STAT3作为IL-6的下游效应分子发挥了重要的作用,我们最后通过Western Blotting检测白花丹素对胰腺癌细胞和MDSCs中STAT3磷酸化水平的影响。结果在人外周血单个核细胞(PBMC)诱导分化模型中,与阳性对照组相比,白花丹素能够抑制MDSCs的分化,并具有剂量依赖性。同时,白花丹素抑制ARG1和NO在MDSCs中的表达,并降低了MDSCs抑制效应T细胞的能力,从而促进T细胞的增殖。在小鼠原位胰腺癌模型中,与溶剂对照组相比,白花丹素能明显抑制胰腺癌肿瘤的生长,促进小鼠肿瘤中具有抗瘤效果的免疫细胞亚群(CD4~+T、CD8~+T、NKT、γδT)的浸润并抑制免疫抑制细胞MDSCs在脾脏、骨髓和肿瘤组织中的募集。我们还发现,白花丹素能够抑制人的胰腺癌细胞(Panc-1、BxPC3)和小鼠的胰腺癌细胞(Panc02)表达CCL2,并可以通过抑制趋化因子CCL2的表达进一步抑制MDSCs向胰腺癌细胞Panc-1的迁移,而且白花丹素抑制MDSCs表达炎性细胞因子,我们还利用Western Blotting证明了白花丹素可以下调胰腺癌细胞和MDSCs中STAT3的磷酸化水平。结论以上结果表明,白花丹素可以通过抑制MDSCs的分化,抑制MDSCs对效应T细胞的抑制作用,促进肿瘤微环境中抗瘤免疫细胞亚群的浸润以及抑制免疫抑制性细胞MDSCs向肿瘤组织的募集发挥抗胰腺癌的作用。白花丹素可以直接作用于MDSCs或者通过抑制CCL2、IL-6以及其他相关炎性细胞因子的表达间接抑制MDSCs的分化和功能。这些结果提示白花丹素可能是胰腺癌治疗的一个新药,同时为胰腺癌免疫治疗提供新的科学依据。
【图文】：

SEM 来呈现的，采用 ANOVA 检验，以 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。统计图由 GraphPad Prism Version 5.0 来完成。流式数据使用 FlowJo 7.6.1software(Tree Star，Inc，USA)分析。1.2 结果1.2.1 白花丹素抑制 MDSCs 细胞的分化髓系来源的免疫抑制性细胞 MDSCs 在肿瘤免疫逃逸方面发挥重要的作用，体外白花丹素对 MDSCs 分化的直接影响尚无相关报道。已有研究证明人外周血单个核细胞（PBMC）在体外经GM-CSF/IL-6 诱导7天后可分化为 MDSCs 细胞。为了体外研究白花丹素对 MDSCs 的调控作用，我们利用 CD33 磁珠分选人外周血单个核细胞中的髓系来源的细胞，GM-CSF/IL-6 和不同浓度的白花丹素共同处理 CD33+细胞，，7 天后进行 CD33、CD11b、HLA-DR 和 CD15 流式抗体标记，利用流式细胞仪进行 MDSCs 细胞的检测。我们首先圈出 CD33+HLA-DRlow/-细胞群，结果显示：CD33+细胞比例高达 96.7%，证明我们成功分选出 CD33+细胞（图1）

天津医科大学硕士学位论文 一、白花丹素体外抑制 PBMC 向 MDSCs 的分化剂 量 依 赖性 （ 图 2 A 、 C ）。 然 后我 们也 对 其 中的 粒 细 胞样 MDSCs（CD33+HLA-DRlow/-CD11b+CD15+）进行了检测，发现此类细胞群经不同浓度的白花丹素共培养后比例也明显降低，且同样具有剂量依赖性（图 2A、B）。这说明，白花丹素能直接调控 MDSCs 的分化。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2590972