扭肚藤止泻作用机理及物质基础研究

发布时间：2020-03-19 23:08

【摘要】：目的:本研究是在中医药基础理论的指导下,针对目前扭肚藤治疗腹泻的药效物质基础不明确、作用机理不清晰,质量检测指标不能准确反映临床疗效的问题,采用体内、体外药理学研究方法筛选其有效部位,寻找作用通路及靶点;同时,综合运用现代先进的分离手段和分析技术对扭肚藤有效部位的化学成分进行分离纯化,获得有效成分单体,在此基础上进一步筛选具有活性的化合物,并建立与疗效相关的活性成分的质量控制方法,同时考察该成分在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程,从而实现对扭肚藤全面而系统的药效机理、物质基础和质量评价研究,为保证临床用药质量和扭肚藤的合理开发利用奠定基础。方法:1.扭肚藤有效部位的提取采用甲醇冷浸提取,提取液回收甲醇并干燥后的浸膏用适量水分散,依次用不同极性的溶剂萃取,分别得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四个提取部位。2.扭肚藤提取部位的药效学研究(1)采用大黄致小鼠腹泻模型,以小鼠6小时内的稀便率为指标,观察扭肚藤提取部位的止泻作用。(2)采用新斯的明所致小鼠小肠推进亢进模型,以小肠全长和炭末推进的长度计算小肠推进率,观察扭肚藤提取部位对新斯的明所致小鼠小肠推进亢进的影响。(3)采用小鼠扭体法,以小鼠扭体次数为指标评价扭肚藤提取部位的镇痛作用。(4)采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法和醋酸致小鼠毛细血管通透性增高法,通过测定小鼠耳廓肿胀度和腹腔洗液OD值来评价扭肚藤提取部位的抗炎作用。3.止泻有效部位作用机理研究[1](1)选取4个与腹泻及炎症相关的靶标蛋白——BDNF、p38 MAPK、NF-κB p65、p-p38 MAPK作为测定指标,取大黄致泻实验中各组小鼠的回肠组织作为样本,采用Western Blotting法对小鼠回肠组织中的靶标蛋白表达量进行测定。(2)根据靶标蛋白测定结果,采用LPS刺激的RAW264.7炎症细胞模型对扭肚藤甲醇提取物、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取部位的抗炎活性进行筛选。首先采用MTT法检测不同浓度提取部位对RAW264.7细胞生长的影响,确定药物安全浓度后用荧光素酶报告基因法测定加入药物后的含有p-NF-κB-luc质粒的NF-κB~(+/+)RAW264.7中的荧光值;同时,用Griess法检测野生型RAW264.7(WT)细胞上清液中NO的释放量,并用RT-q PCR法测定细胞中i NOS m RNA的表达水平。4.有效部位化学成分的分离纯化采用系统分离法,综合运用MCI Gel、Diaion HP-20、Sephadex LH-20、硅胶等柱层析及制备型高效液相等多种色谱技术对扭肚藤的有效部位化学成分进行分离纯化,获得有效成分单体,并结合ESI-MS、1~H NMR、~(13)C NMR等波谱分析方法对所得化合物进行结构鉴定。5.有效成分的抗炎活性筛选利用LPS诱导的RAW 264.7炎症细胞模型,考察各待测有效成分单体对该细胞中NO的生成和NF-κB转录活性的影响。MTT法检测不同浓度化合物对RAW264.7细胞生长的影响,在化合物的无毒浓度下,采用Griess法检测细胞上清液中NO的释放量,同时测定LPS诱导的NF-κB~(+/+)RAW 264.7细胞的荧光值,实现抗炎活性成分的快速筛选。6.质量评价研究以咖啡酸甲酯和异绿原酸B两个主要活性成分为指标,采用超高效液相色谱法建立扭肚藤的UPLC指纹图谱及有效成分的含量测定方法,并对所建立的方法进行方法学考察。7.药代动力学研究采用超高效液相-质谱(UPLC-MS/MS)法对大鼠灌服扭肚藤甲醇提取物后血浆样品中咖啡酸甲酯和异绿原酸B的浓度进行测定,利用BAPP2.0药动学软件对血药浓度进行数据处理,得到各项药动学参数,明确该成分被机体吸收利用的程度。结果:1.从扭肚藤药材中提取得到甲醇总提取物及石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇4个不同极性的提取部位。2.大黄所致小鼠腹泻动物实验结果表明,扭肚藤的三氯甲烷和乙酸乙酯提取部位能显著降低小鼠稀便率,具有一定的止泻作用;扭肚藤对新斯的明所致小鼠小肠推进亢进的影响实验表明,三氯甲烷及乙酸乙酯提取部位的高、低剂量组,石油醚提取部位的高剂量组均能显著降低新斯的明所致小肠推进亢进小鼠的小肠推进率;镇痛实验结果表明,乙酸乙酯及正丁醇提取部位能显著降低小鼠扭体次数,具有明显的镇痛作用;抗炎实验结果表明,扭肚藤三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取部位及甲醇总提取物均能降低二甲苯所致小鼠的耳廓肿胀度,提示对急性炎性肿胀具有抑制作用;石油醚、三氯甲烷及正丁醇提取部位在高剂量时能显著降低醋酸所致小鼠的毛细血管通透性,提示对炎性过程中毛细血管通透性增高具有一定的抑制作用。3.扭肚藤三氯甲烷提取部位能显著降低BDNF、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65在大黄致泻小鼠模型回肠组织中的表达量。4.扭肚藤各提取部位浓度低于100μg/m L时,对RAW264.7细胞的生长无明显的影响,细胞存活率在85%以上。三氯甲烷提取部位在无毒浓度范围内可增加LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NF-κB转录活性及NO生成的抑制率,降低细胞中致炎因子NO的含量,并降低细胞中i NOS的m RNA水平的表达量。5.从扭肚藤的有效部位中分离得到17个化合物,分别鉴定为原儿茶酸、原儿茶酸甲酯、咖啡酸、咖啡酸甲酯、水杨酸、异香草酸、阿魏酸、咖啡碱、3,6-diisopropylpiperazin-2,5-dione、东莨菪内酯、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-hydroxy-4-(3-hydroxy-1-butenyl)-3,5,5-trimethyl-2-Cyclohexen-1-one、3-吲哚甲醛、3,4-O-二咖啡酰基-奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基-奎宁酸、3,4-O-二咖啡酰基-奎宁酸甲酯、3,5-O-二咖啡酰基-奎宁酸甲酯。6.咖啡酸甲酯对NF-κB的活性和NO的生成具有抑制作用,给药浓度为12.5,25,50μM时,对NF-κB活性的抑制率分别为34.65%、33.44%和36.12%,对NO生成的抑制率分别为39.28%、45.48%和47.89%,且对RAW264.7细胞的生长无明显的影响。7.建立了扭肚藤药材的UPLC指纹图谱,10批扭肚藤药材有9批相似度达到了0.9以上;异绿原酸B和咖啡酸甲酯分别在7.67~38.35μg/m L和9.60~76.8μg/m L范围内呈良好的线性关系,平均回收率分别为98.61%、99.09%,RSD分别为0.84%、1.25%。8.建立了同时测定大鼠口服扭肚藤提取物后,血浆中异绿原酸B和咖啡酸甲酯两种活性成分的含量测定方法。方法学考察表明,血浆中异绿原酸B和咖啡酸甲酯在1~1000ng/m L浓度范围内线性关系良好,日内与日间精密度均少于15%,其准确性分别在97.54%~107.44%和95.98%~110.73之间,精密度和准确性较好,提取回收率均大于90%,分别为99.45%~107.93和100.38%~104.52%。异绿原酸B和咖啡酸甲酯在大鼠体内的最大血药浓度C_(max)分别为262.03和575.35 ng/m L,达峰时间T_(max)分别为0.25和0.5小时,半衰期T1/2分别为0.75小时和1.32小时,血药浓度-时间曲线下峰面积AUC0~τ分别为290.12和879.85 hng/mL。结论:动物体内药效学实验研究结果表明,扭肚藤的三氯甲烷和乙酸乙酯部位的止泻作用较明显,此外还显示出一定的抗炎作用;乙酸乙酯及正丁醇部位显示出明显的镇痛作用。体外细胞实验结合体内药效学实验研究进一步验证了三氯甲烷提取部位是扭肚藤抗炎止泻最主要的有效部位,其次是乙酸乙酯提取部位。两个有效部位均是通过调控NF-κB炎症通路,抑制NF-κB转录因子的活化,在转录水平上抑制i NOS等促炎因子的表达,减少NO的释放从而减轻炎症反应产生止泻的作用。体外细胞模型对有效部位所分离得到的化合物进行活性筛选结果显示,咖啡酸甲酯具有较好的抗炎活性,异绿原酸B也显示一定的抗炎活性,是扭肚藤抗炎止泻的主要物质基础,其机理与抑制NF-κB的转录活性,减少NO的生成有关。在此基础上建立的基于活性成分的扭肚藤的指纹图谱及含量测定方法简单、准确、重复性好,能有效地控制扭肚藤的质量,保证临床用药的有效性。同时,对活性成分在大鼠体内的药代动力学研究表明,咖啡酸甲酯和异绿原酸B能进入体内并被吸收利用而后消除。本研究明确了扭肚藤止泻的作用机理和物质基础,为扭肚藤药材的深入开发利用提供了科学依据。
【图文】：

作用机理,胃肠激素

3.4 干预胃肠激素的分泌胃肠激素是调节胃肠运动的肽类，胃动素（MOT）可加强平滑肌收缩，加速胃排空，减少食物在小肠内的停留时间［76］。胃泌素（GAS）等胃肠激素可刺激胃肠道分泌的功能，分泌过多则可导致腹泻［77］。生长抑素（SS）的生理作用包括抑制生长激素，抑制胃泌素使胃酸及胃蛋白酶减少，抑制胰腺激素分泌等［78］。研究表明，急性腹泻患者血浆 MOT 水平显著升高，症状缓解后则显著下降，GAS 在急性重症腹泻患者中也有所升高［79］。药物通过升高血浆 LDH 水平，同时降低血浆中的胃动素和生长激素水平，可抑制胃肠运动，达到温脾止泻的功效［80］。3.5 调节水电解质平衡，保护肠黏膜腹泻发生时，腺苷酸环化酶被活化，，细胞内的 ATP 转变成 cAMP，肠黏膜细胞cAMP 含量迅速增加。Na+-K+-ATP 酶活性改变，使肠黏膜细胞液中的 K+溢出，Na+，Cl-等水分进入细胞内使细胞肿胀坏死，增加肠腔水分的分泌而导致腹泻，同时引起机体电解质紊乱。研究发现，水电解质紊乱可能与水通道蛋白家族（AQP4 和 AQP8）、图 1-1 NF-κB 通路作用机理图

基本思路,实施方案

本论文研究的基本思路和实施方案
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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