应用新型断接式发夹探针技术检测CYP2C8基因SNP的研究
发布时间：2017-06-28 08:13
本文关键词：应用新型断接式发夹探针技术检测CYP2C8基因SNP的研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：背景与目的:乳腺癌的联合化疗是该病治疗的主要方法之一,其对患者预后有显著的改善作用,但化疗的药效和毒副作用在不同个体的差异显著,研究表明这与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)关系密切,但相关的多基因SNP与疗效之间的精确关联,目前国内外尚未见报道。发夹探针是一类适用于SNP等单个碱基突变检测的重要工具,将发夹探针固定在载体表面可进行多位点SNP检测,但是作为发夹探针技术优势的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)现象因在实际应用中难以保留而使发夹探针的应用受到较大的制约。为了解决这一问题,国内外的主要改进方法都是采用探针茎臂修饰的方式,但这种方式的技术难度较大,且运用也受到一定的限制。为此,在本研究中,我们综合各种改良设计的利弊,提出了新型断端对接式发夹探针技术,以荧光素/淬灭素断端对接/紧密接触的方式,使探针原始核心技术-FRET现象以不同的方式实现;并结合纳米磁珠的强大荧光信号富集放大效应,建立基于断接式发夹型探针结合磁珠的信号放大系统,该技术使该探针的检测效果更加优化。方法:1.通过NCBI Gen Bank查得乳腺癌治疗常用的联合化疗药物紫杉醇、阿霉素在肝内代谢的重要相关基因CYP2C8的序列,以该基因的原始序列和139A/G位点SNP突变序列分别作为后续试验用的原始靶序列和突变靶序列,并运用生物信息学软件根据靶序列设计用于检测CYP2C8基因SNP突变的断接式发夹探针。通过探针比例和杂交温度摸索,最终确定检测体系的最适探针浓度比和最适温度,来区分靶序列和突变靶序列。2.将上述获得的断接式发夹型DNA探针与纳米磁珠进行固定,建立断接式发夹探针纳米磁珠信号放大系统,并将固定断接式发夹型DNA探针的纳米磁珠收集在离心管中,进行纳米磁珠荧光信号富集的信号放大效果检测,同时选取探针进行标记修饰,对该系统进行条件优化,并在荧光显微镜下观察和比较靶序列和突变序列的荧光,摸索集合磁珠检测体系的最佳浓度和温度以及时间。3.收集50例乳腺癌患者的血液标本,提取这些患者的全血基因组DNA,设计并合成CYP2C8基因139A/G SNP位点突变检测引物,进行人CYP2C8基因的PCR扩增,并对CYP2C8基因片段进行切胶回收;利用已经成功建立的断接式发夹型探针结合磁珠的信号放大系统对其进行验证,明确新构建方法临床检测的准确性和可靠性,并对其检测效果进行初步鉴定。结果:1.CYP2C8基因序列第139个编码氨基酸的碱基序列为AGG,发生SNP突变后为AAG。经探针设计和条件摸索,CYP2C8的139A/G SNP检测体系的最适杂交温度为40℃,最佳探针比例为荧光探针P1:淬灭探针P2为1:4,最佳杂交时间固定磁珠为2h,经过优化的CYP2C8 SNP检测体系对139A/G的突变检测效果显著。2.成功构建了以断接式发夹型DNA探针为识别分子并固定的纳米磁珠,且富集纳米磁珠的信号放大系统的检测效果显著,能够更高效、更灵敏地区分CYP2C8基因的SNP位点原始序列和突变序列的荧光信号强度,提示断接式发夹型探针结合磁珠的信号放大系统初步构建成功。3.提取乳腺癌患者DNA浓度较高,CYP2C8基因139A/G SNP位点突变序列扩增效果良好,所得片段与设计引物时预期片段大小(153bp左右)一致。断接式发夹型探针结合磁珠的信号放大系统对CYP2C8基因139A/G SNP位点突变的检测效果确切。结论:1.本研究成功建立了运用断接式发夹型DNA探针检测SNP位点的新反应体系,该体系可以对乳腺癌化疗药物代谢相关的CYP2C8基因第139个编码氨基酸位置的SNP位点突变进行高效的检测。2.在发夹探针的基础上,本研究初步建立了断接式发夹型探针结合磁珠的信号放大系统,其对CYP2C8基因139A/G SNP位点突变的检测效果显著,是一种简单、高效地检出SNP位点的新方法,可能为临床药物的个体化应用和新药靶点研究等提供重要的检测手段。
【关键词】：CYP2C8基因 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism SNP) 断接式发夹型DNA探针 分子信标 纳米磁珠
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9;R730.43
【目录】：
- 缩略语表4-5
- Abstract5-8
- 摘要8-10
- 第一章 前言10-13
- 第二章 CYP2C8基因 139A/G断接式发夹型DNA探针设计及验证13-27
- 2.1 试剂及配制14-16
- 2.2 结果16-23
- 2.3 讨论23-26
- 2.4 小结26-27
- 第三章 基于断接式发夹探针技术的纳米磁珠信号放大检测系统的初步构建27-40
- 3.1 材料与方法28-31
- 3.2 结果31-37
- 3.3 讨论37-39
- 3.4 小结39-40
- 第四章 基于断接式发夹型DNA探针技术的初步应用40-50
- 4.1 材料与方法40-44
- 4.2 结果44-47
- 4.3 讨论47-48
- 4.4 小结48-50
- 全文结论50-51
- 参考文献51-57
- 文献综述57-65
- 参考文献62-65
- 攻读学位期间发表的论文65-66
- 致谢66
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本文编号：493179
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