靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞（mesoCAR-T）治疗肝癌的实验研究
本文关键词：靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞（mesoCAR-T）治疗肝癌的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：癌症现在已成为人类健康的头号杀手,世界范围内,肝癌发病率在所有癌症中居第六位,每年约有750万新增病例,死亡率高居第三位。快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶,使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。早期肝癌进行有效治疗后五年生存率能达到50% 70%。但是由于肝癌早期诊断技术的限制,肝癌总的五年生存率只有10%。目前常用的治疗手段主要包括手术切除、肝脏移植、化疗、化疗栓塞、射频消融、质子射线疗法等,但效果十分有限。因此,仍需探索一个更加有效的治疗方法,来提高肝癌生存率和生存质量。近年来免疫疗法的兴起,即利用自身免疫系统来抵御癌症,给癌症患者带来了新的希望。然而,癌症患者自身的免疫系统受损严重,狡猾的肿瘤细胞又会通过MHC分子的低表达或不表达来逃脱免疫细胞的攻击,这些都给治疗带来了很大困难。因此,精密制导、精准打击的免疫细胞武器—CAR-T技术应运而生。CAR-T细胞,即嵌合型抗原受体修饰的T细胞,这种通过基因修饰T细胞的过继性免疫细胞疗法,可以克服MHC介导的免疫逃逸机制,快速建立肿瘤免疫并消除小型或大型肿瘤负担,被认为是一种很有前景的治疗策略。尤其是靶向CD19的CAR-T细胞在恶性血液病中取得的巨大成功,开创了肿瘤生物治疗的新纪元。CAR-T技术虽在恶性血液病中获得惊人效果,运用到实体瘤时却处处碰壁,除了实体瘤更加复杂的肿瘤抑制微环境外,还面临着很多问题:缺乏类似于CD19这样特异的靶点,转染效率不高,CAR的数量和CAR的亲和力等。本文构建并检测了针对间皮素的第二代CAR T细胞对几种肝癌细胞株的体外杀伤作用:(1)构建包含CD3ζ和4-1BB两个胞内共刺激区的mesoCAR,通过piggy Bac转座子系统转染T细胞,获得mesoCAR-T细胞。替代常用的慢病毒载体转染方式,其阳性率可达到66%。流式检测K562-meso刺激下mesoCAR-T的活化表型(CD137,CD28,CD27,CD134,CD38,CD107α),结果显示mesoCAR-T细胞可被K562-meso细胞激活。(2)通过RT-PCR、Western Blot检测多种肿瘤细胞株间皮素的表达水平,并人工构建间皮素高表达细胞株。筛选出了四种不同表达水平的肝癌细胞株,检测mesoCAR-T细胞对高表达(SMMC-7721、BEL-7404)及低表达细胞株(Hep G2、Huh7)的杀伤作用差异。结果显示mesoCAR-T细胞对间皮素高表达细胞株的杀伤作用明显强于低表达或不表达间皮素的细胞株,表明构建的mesoCAR-T细胞具有一定的特异性。(3)通过检测mesoCAR-T细胞的细胞因子发现,IFN-γ、TNF-α、、IL2的分泌明显高于对照组T细胞。mesoCAR-T与肿瘤细胞共培养IFN-γ的分泌量与肿瘤细胞株间皮素的表达量也基本成正比关系。(4)SMMC-7721小鼠移植瘤模型中,与PBS和control T细胞组相比,mesoCART细胞治疗组对肿瘤的抑制作用更强,且能在体内更好地增殖。本文构建的mesoCAR-T细胞,在转染效率、免疫细胞因子的分泌、体内外杀伤方面都表现出较好的效果,为其在临床上的应用奠定了基础。
【关键词】：CAR 间皮素 免疫疗法 piggyBac 肝癌
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-8
- 缩略词表8-13
- 第一章 嵌合型抗原受体T细胞（CAR-T）概念及研究进展13-21
- 1.1 嵌合型抗原受体T细胞的概念13-15
- 1.2 T细胞的抗肿瘤机制15-16
- 1.3 CAR-T疗法的研究进展16-17
- 1.4 间皮素作为肿瘤治疗靶点的研究进展17-19
- 1.4.1 间皮素的发现及特征17-18
- 1.4.2 以间皮素为靶点的探索18
- 1.4.3 间皮素CAR-T的研究进展18-19
- 1.4.4 间皮素CAR-T细胞的脱靶毒性19
- 1.5 PB转座子19-20
- 1.6 本课题的研究内容20-21
- 第二章 靶向间皮素的嵌合型抗原受体修饰的T细胞（mesoCAR-T）构建21-33
- 2.1 实验器材21-23
- 2.1.1 实验仪器21
- 2.1.2 实验材料21
- 2.1.3 引物设计21-22
- 2.1.4 实验试剂22
- 2.1.5 实验试剂的配制22-23
- 2.2 实验方法23-28
- 2.2.1 大量抽提载体质粒PNBS328、pGH-mesoCAR23-24
- 2.2.2 酶切、连接、转化24-25
- 2.2.3 小量抽提质粒、酶切鉴定25-26
- 2.2.4 电转染获得mesoCAR-T细胞26
- 2.2.5 检测T细胞中mesoCAR的表达26-28
- 2.3 实验结果28-32
- 2.3.1 mesoCAR基因结构示意图28-29
- 2.3.2 PNBS328-mesoCAR质粒构建结果29-30
- 2.3.3 T细胞形态30
- 2.3.4 转染效率检测结果30-32
- 2.4 结果分析与讨论32-33
- 第三章 间皮素高表达肝癌细胞株的筛选和人工构建33-41
- 3.1 实验器材33-34
- 3.1.1 实验仪器33
- 3.1.2 引物设计33
- 3.1.3 实验试剂33
- 3.1.4 实验试剂的配置33-34
- 3.2 实验方法34-38
- 3.2.1 各肿瘤细胞系的复苏及培养34-35
- 3.2.2 RT-PCR检测各细胞系中间皮素的表达35-36
- 3.2.3 Western Bolt检测各细胞系中间皮素的表达36
- 3.2.4 构建间皮素高表达细胞株─293-meso36-38
- 3.3 实验结果38-39
- 3.3.1 各肿瘤细胞株间皮素抗原的RT-PCR结果38
- 3.3.2 各肿瘤细胞株间皮素抗原的WB检测结果38-39
- 3.3.3 构建的 293-meso细胞39
- 3.4 结果分析与讨论39-41
- 第四章 mesoCAR-T细胞的功能分析41-51
- 4.1 实验器材41
- 4.1.1 实验仪器41
- 4.1.2 实验材料41
- 4.2 实验方法41-43
- 4.2.1 流式检测mesoCAR-T细胞表型41
- 4.2.2 流式检测mesoCAR-T细胞胞内细胞因子41-42
- 4.2.3 检测mesoCAR-T细胞的体外杀伤能力42
- 4.2.4 LDH法检测CAR-T细胞的杀伤能力42-43
- 4.2.5 Elisa检测共培养条件下CAR-T细胞IFN-γ的分泌43
- 4.3 实验结果43-50
- 4.3.1 抗原刺激下mesoCAR-T细胞表型43-45
- 4.3.2 实时监测系统检测mesoCAR-T对肿瘤细胞株的杀伤作用45-47
- 4.3.3 LDH法检测mesoCAR-T细胞对K562-meso的杀伤47-48
- 4.3.4 RTCA检测mesoCAR-T细胞对239和 293-meso的杀伤48
- 4.3.5 检测mesoCAR-T细胞因子的流式结果48-49
- 4.3.6 mesoCAR-T细胞与肿瘤细胞共培养IFN-γ的分泌49-50
- 4.4 结果分析与讨论50-51
- 第五章 SMMC-7721 小鼠移植瘤模型实验51-53
- 5.1 实验材料51
- 5.2 实验方法51
- 5.3 实验结果51-52
- 5.4 结果分析与讨论52-53
- 讨论53-55
- 参考文献55-63
- 致谢63
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