新型纳米药物载体在逆转肿瘤细胞耐药性方面的应用研究
发布时间：2017-07-01 02:05
本文关键词：新型纳米药物载体在逆转肿瘤细胞耐药性方面的应用研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的乳腺癌是严重威胁女性健康的常见肿瘤。虽然近年来在其诊断及治疗方面有了长足的进步,但乳腺癌患者的死亡率仍然居高不下,其中一个主要的原因就是肿瘤细胞可产生多药耐药性(Multidrug resistance, MDR),大幅减弱化疗药物对肿瘤细胞的杀伤,从而导致90%的晚期肿瘤化疗的失败。槲皮素(Quercetin,Q)是一种天然的黄酮类化合物,有研究显示,槲皮素有助于逆转肿瘤细胞的多药耐药性。然而,由于槲皮素水溶性差、吸收差,限制了其在临床上的应用,因而迫切需要开发能够在水溶液中稳定存在的高效载药系统来运载槲皮素。聚合物胶束是近年来出现的一种新型纳米药物载体,同时具有亲水性外壳和疏水性内核,具有多种优良的性能,如在体内外环境中较高的稳定性、对难溶性药物的增溶作用等。聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)是经美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准的可用于人体的药物载体材料,具有良好的生物相容性和安全性。然而,迄今为止尚未有对于载有槲皮素的PEG-PE胶束逆转肿瘤细胞耐药性的报道。本研究利用PEG-PE胶束可携带难溶性药物的特性,制备出载有槲皮素的PEG-PE胶束(quercetin-loaded PEG-PE Micelles, M-Q),并在体外初步评估了其对耐阿霉素人乳腺癌细胞(MCF-7 ADRr)耐药性的逆转效应。方法将mPEG2000-PE和槲皮素分别溶于三氯甲烷和无水乙醇中,以不同的浓度比混合此两种有机溶液,然后将混合溶液置于氮气环境下蒸发至形成一层均匀干燥薄膜,静置2h之后,加入0.9%氯化钠注射液使薄膜水合。50℃水浴下水化30min后,常温静置2h,即制备出M-Q。用动态光散射仪表征其尺寸分布及Zeta电位；采用超速离心法分离游离药物后以紫外分光光度法测定其包封率；将其联合阿霉素一起与MCF-7 ADRr细胞共孵育72h,用MTS方法检测肿瘤细胞的存活率,并测定其对MCF-7 ADRr细胞耐药性的逆转作用是否优于游离槲皮素；为评价PEG-PE胶束自身对靶细胞有无杀伤作用,将MCF-7 ADRr细胞分别与不同浓度的PEG-PE胶束孵育72h,用MTS方法检测肿瘤细胞的存活率。结果(1)利用动态光散射仪分别测定了空胶束和载药胶束的粒径,结果显示,空胶束与载药胶束的粒径相似,无明显差异,平均粒径在11.11nm左右,空胶束与载药胶束的Zeta电位分别为-0.165mV和-0.406mV。(2)PEG-PE聚合物胶束能有效运载槲皮素,其包封率高达74%以上。(3)MTS杀伤结果显示,M-Q能在体外有效逆转MCF-7 ADRr细胞对于阿霉素的耐药性,且其逆转作用优于游离槲皮素(p0.05)。(4)本实验中所用的PEG-PE胶束的安全性较好,在15-120μmol/L的浓度范围内,对MCF-7 ADRr细胞无明显杀伤作用。结论载有槲皮素的PEG-PE胶束能够在体外有效逆转MCF-7 ADRr细胞对于阿霉素的耐药性,且其逆转作用显著优于游离槲皮素。该结果提示,载有槲皮素的PEG-PE胶束在逆转肿瘤耐药性方面具有潜在的应用价值。目的肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在男性居恶性肿瘤的第1位,在女性居第2位。近十年来,肺癌的发病率和死亡率一直处于持续增长的状态。令人担忧的是,即使经过治疗,肺癌患者的五年存活率依然低于15%。化疗是晚期肺癌的主要治疗方法之一,然而肺癌化疗的效果并不十分理想,导致化疗失败的主要原因之一是肿瘤细胞多药耐药性(Multidrug resistance,MD巧的产生。为了克服肿瘤细胞的MDR,人们一直在探索新型的纳米载药系统来提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。DNA纳米技术己逐渐成为纳米医学研究的热点。DNA纳米技术的快速发展使得DNA作为一种优势材料被广泛使用。通过利用碱基配对法则,设计并合成大量不同几何结构的DNA纳米结构。在众多DNA纳米结构中,由于DNA四面体具有简易自组装及高产的优良特性,被认为是最实用的DNA纳米结构之一。迄今为止,尚未有DNA四面体对肺癌细胞耐药性影响的评估,本研巧利用DNA四面体的高效自组装特性W及阿霉素自动嵌入DNA的特性,构建出载有阿霉素的DNA四面体,并在体外初步评估了其对耐阿霉素人肺腺癌细胞(A549 ADRr)耐药性的逆转效应。方法将溶解于TTE缓冲液的4条单链DNA(A、B、C和巧同化例混合于TM缓冲液,置于95’C水浴加热2min,再置于冰浴降温,即形成DNA四面体。利用琼脂糖凝胶电泳法观察DNA四面体的条带位置,分析DNA四面体的构建情况。取不同摩尔比的DNA四面体和网霉素混合,在黑色%孔板中静置,待阿霉素充分嵌入DNA四面体后,即构建出载有阿霉素的DNA四面体。利用芙光光谱分析仪检测阿霉素巧光光谱值的变化,分析DNA四面体的载药情况;通过动态光散射仪表征其尺寸分布及Zeta电位;将载有阿霉素的DNA四面体与A549AD化细胞共解育48h,用MTS法检测对肿瘤细胞的杀伤率,并测定其对A549八D化细胞的杀伤作用是否优于游离阿霉素。结果利用琼脂糖凝胶电泳法观察到DNA四面体的条带位置高于其他两组(A+B、A+B+C)0(2卿用动志光散射仪测定了DNA四面体的粒径和Zeta电位,结果显示,平均粒径在13.81nm左右,Zeta电位为-0.427mV。(3巧0用巧光光谱分析仪检测阿霉素巧光光谱值的变化,结果表明载药四面体构建成功。(4)MTS杀伤结果显示,当阿霉素浓度15^imol/L时,载有阿霉素的DNA四面体在体外有助于逆转A549ADRT细胞对于阿霉素的耐药性(p0.05)。(5)DNA四面体自身对{南赴廾飨陨鄙俗饔谩＝崧墼赜邪⒚顾氐腄NA四面体在体外有助于逆转A549 ADRr细胞对于阿.霉素的耐药性。该结果提示,DNA四面体作为一种新型的纳米载药系统,在逆转肿瘤耐药性方面具有潜在的应用价值。
【关键词】：PEG-PE 胶束 槲皮素 MCF-7 ADRr细胞 DNA四面体 阿霉素 A549ADRr细胞
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：
- 第一部分 载有槲皮素的PEG-PE胶束对乳腺癌细胞耐药性的逆转效应6-46
- 摘要6-8
- 英文摘要8-10
- 第一章 前言10-22
- 1. 多药耐药性(Multidrug resistance,MDR)10-11
- 1.1 MDR的定义10-11
- 1.2 MDR的机制11
- 1.3 MDR的逆转方法11
- 2. 槲皮素11-17
- 2.1 槲皮素简介11-12
- 2.2 槲皮素的药理作用12-16
- 2.3 槲皮素应用中存在的问题16-17
- 3. 聚合物胶束——一种新型的纳米药物载体17-20
- 3.1 聚合物胶束简介17
- 3.2 聚合物胶束的物理性质17-18
- 3.3 聚合物胶束的制备方法18-19
- 3.4 载体材料——聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)19-20
- 4. 本课题立项依据及研究意义20-21
- 5. 研究策略和技术路线21-22
- 5.1 拟解决的科学问题21
- 5.2 研究策略和技术路线21-22
- 第二章 材料与方法22-30
- 1. 主要材料与试剂22-23
- 1.1 细胞系22
- 1.2 mPEG_(2000)-PE22
- 1.3 阿霉素22
- 1.4 细胞培养试剂22
- 1.5 试剂盒22
- 1.6 化学试剂22-23
- 1.7 溶液的配置23
- 1.8 细胞培养耗材23
- 2. 实验仪器和设备23-24
- 3. 实验方法24-29
- 3.1 PE的制备24
- 3.2 mPEG_(2000)-PE的制备24-25
- 3.3 PEG-PE胶束的制备25
- 3.4 载有槲皮素的PEG-PE胶束(M-Q)的制备25-26
- 3.5 空胶束和载药胶束的粒径及Zeta电位的检测26
- 3.6 M-Q包封率及载药率的测定26-27
- 3.7 MCF-7和MCF-7 ADRr细胞系的培养27
- 3.8 细胞计数与操作方法27
- 3.9 M-Q对于MCF-7 ADRr细胞耐药性的逆转效应27-29
- 3.10 PEG-PE胶束自身对靶细胞的影响29
- 4. 统计学分析29-30
- 第三章 实验结果与分析30-38
- 1. M-Q的理化性质30-32
- 1.1 外观30
- 1.2 粒径30-31
- 1.3 Zeta电位31-32
- 2. M-Q的载药率和包封率32-35
- 2.1 分离胶束化槲皮素和游离槲皮素32-33
- 2.2 测定沉淀中游离槲皮素的含量33-34
- 2.3 M-Q包封率及载药率的测定34-35
- 3. M-Q对于MCF-7 ADRr细胞耐药性的逆转效应35-37
- 4. PEG-PE胶束自身对靶细胞的影响37-38
- 第四章 讨论与结论38-39
- 1. 讨论38
- 2. 结论38-39
- 参考文献39-46
- 第二部分 载有阿霉素的DNA四面体对肺癌细胞耐药性的逆转效应46-70
- 摘要46-48
- Abstract48-50
- 第一章 前言50-53
- 第二章 材料和方法53-61
- 1. 主要材料与试剂53-55
- 1.1 细胞系53
- 1.2 阿霉素53
- 1.3 单链寡核苷酸53
- 1.4 细胞培养试剂53-54
- 1.5 试剂盒54
- 1.6 化学试剂54
- 1.7 溶液的配置54-55
- 1.8 细胞培养耗材55
- 2. 实验仪器和设备55-56
- 3. 实验方法56-60
- 3.1 DNA四面体的构建及检测56
- 3.2 DNA四面体粒径及Zeta电位的检测56-57
- 3.3 载有阿霉素的DNA四面体的构建及检测57
- 3.4 A549和A549 ADRr细胞系的培养57
- 3.5 细胞计数与操作方法57
- 3.6 载有阿霉素的DNA四面体对于A549 ADRr细胞耐药性的逆转效应57-59
- 3.7 DNA四面体自身对靶细胞的影响59-60
- 4. 统计学分析60-61
- 第三章 实验结果与分析61-66
- 1. DNA四面体的检测61
- 2. DNA四面体的粒径和Zeta电位61-62
- 3. 载有阿霉素的DNA四面体的构建及检测62-63
- 4. 载有阿霉素的DNA四面体对于A549 ADRr细胞耐药性的逆转效应63-65
- 5. DNA四面体自身对靶细胞的影响65-66
- 第四章 讨论与结论66-68
- 1. 讨论66-67
- 2. 结论67-68
- 参考文献68-70
- 附录一 英文缩略词汇表70-71
- 附录二 个人简历71-72
- 致谢72-74
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 吴春;孔琪;李健;许威;;槲皮素微胶囊的稳定性及缓释性能研究[J];化学与黏合;2006年01期
2 杜方兵;包明红;梅晓冬;;槲皮素对多药耐药细胞株KB-MRP的耐药逆转研究[J];临床肿瘤学杂志;2007年09期
3 林宏英;陆晓燕;唐宁;梁伟;;长春新碱PEG-PE胶束的制备及其对乳腺癌细胞生长的抑制[J];生物化学与生物物理进展;2006年08期
4 于志君;何丽娅;陈勇;吴勉云;赵雪花;王震宇;;槲皮素对胃癌MGC-803细胞VEGF-C及VEGFR-3表达水平的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年08期
5 刘爽;姚平;李珂;林杰;郝丽萍;刘烈刚;;槲皮素对大鼠原代肝细胞酒精性氧化损伤的防护作用[J];营养学报;2007年03期
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本文编号：504205
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