Mcl-1参与NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性调控的实验研究

发布时间：2017-07-06 13:22

  本文关键词：Mcl-1参与NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性调控的实验研究

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【摘要】：Mcl-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)是Bcl-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)抗凋亡蛋白家族成员,参与调控细胞的凋亡与存活。Mcl-1在许多正常组织中广泛表达,对维持多种细胞的成熟与分化具有重要的意义。Mcl-1表达的上调提示了肿瘤的发生,而在多种人类癌组织中,Mcl-1确实存在过表达现象。此外,Mcl-1的过表达还可以诱导细胞对一些治疗药物产生耐受作用。由此可见,作为癌症靶向新型位点,Mcl-1在诱导肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤方面可能发挥重要的作用。本实验以含EGFR突变的PC-9细胞系以及含EML4-ALK基因融合的H3122细胞系为研究对象,观察Mcl-1调控NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性的作用及相关机制。第一部分:通过Western blot方法,检测EGFR抑制剂和ALK抑制剂诱导NSCLC细胞凋亡信号通路以及凋亡过程中起关键作用的调控分子。结果显示:EGFR和ALK抑制剂通过调控Bcl-2家族蛋白的表达,活化Caspase-3信号途径,进而诱导NSCLC细胞凋亡,Mcl-1则作为参与此凋亡信号通路的一个关键分子。第二部分:观察Mcl-1调控NSCLC细胞对EGFR和ALK抑制剂敏感性的作用。实时定量PCR、Western blot以及免疫共沉淀实验等检测Mcl-1的表达,结果显示EGFR和ALK抑制剂并非在转录水平下调Mcl-1,而是在蛋白降解水平下调Mcl-1。通过MTT实验检测到临床上还有一些EGFR野生型病人对Gefitinib敏感,而对这些Gefitinib敏感型细胞给予Gefitinib处理后Mcl-1表达下调。Western blot检测对Gefitinib敏感细胞及耐药细胞给予Gefitinib处理后中Mcl-1的表达及细胞的凋亡情况,结果发现随着药物浓度的增大,敏感细胞株凋亡片段增多,Mcl-1表达减少;而耐药细胞株未出现明显的凋亡片段,Mcl-1的表达无明显减少。特异性敲除耐药细胞中Mcl-1基因,流式细胞技术检测细胞,结果显示细胞凋亡明显增多。第三部分:探讨Mcl-1调控EGFR突变细胞对EGFR抑制剂敏感性的相关机制。Western blot检测分别给予Gefitinib、Akt抑制剂以及Erk抑制剂处理后,PC-9细胞内Mcl-1的表达情况,结果发现:EGFR抑制剂通过下调p Akt来抑制pGSK3β的表达,使Mcl-1磷酸化水平增加,进而被泛素修饰,并经泛素化途径降解。通过免疫共沉淀以及Western blot实验验证:FBW7是介导Mcl-1泛素化修饰的泛素连接酶,下调FBW7的表达可以抑制Mcl-1蛋白的降解。
【关键词】：非小细胞肺癌 Mcl-1 凋亡 吉非替尼
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-11
• 文献回顾11-20
• 第一部分 EGFR和ALK抑制剂诱导NSCLC细胞凋亡的分子机制研究20-35
• 1 材料20-24
• 2 方法24-27
• 3 结果27-32
• 4 讨论32-35
• 第二部分 MCL-1 参与EGFR和ALK抑制剂敏感性调控的实验研究35-54
• 1 材料35-39
• 2 方法39-43
• 3 结果43-51
• 4 讨论51-54
• 第三部分 MCL-1 调控EGFR突变细胞对EGFR抑制剂敏感性的分子机制研究54-63
• 1 材料54-56
• 2 方法56-58
• 3 结果58-61
• 4 讨论61-63
• 小结63-64
• 参考文献64-74
• 个人简历和研究成果74-75
• 致谢75

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本文编号：526419