MicroRNA-21靶向Fas Ligand抑制结肠癌细胞的凋亡和对5-FU的化学敏感性

发布时间：2017-07-14 07:00

  本文关键词：MicroRNA-21靶向Fas Ligand抑制结肠癌细胞的凋亡和对5-FU的化学敏感性

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【摘要】：结肠癌是全球死亡率第三高的恶性肿瘤。有研究表明miRNA及其相关靶基因都与肿瘤细胞耐药性增加和细胞凋亡有关。本文揭示miR-21及其靶基因FasL在结肠癌细胞发展过程中的关系。本实验主要通过软件TargetScan, PicTar, microRNA.org 和 miRecords 及 q-RT-PCR预测miR-21的靶基因,双荧光素酶报告系统确定FasL为miR-21的直接靶基因。Pre-miR-21, siFasL和对照NC分别转染进RKO-WT细胞,通过CCK-8检测细胞活性,同时通过q-RT-PCR和Western Blotting检测FasL的表达及caspase-3和裂解caspase-3的蛋白表达水平,得到以下结果：1.结肠癌RKO细胞中,FasL为miR-21的直接靶基因；2.MiR-21通过靶向FasL的3’UTR区抑制其在：nRNA和蛋白水平的表达；3.外源的pre-miR-21前体转染进RKO-WT细胞,使miR-21过表达,明显抑制FasL的表达,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡；4.外源的siFasL转染进RKO-WT细胞,使FasL表达被抑制,会促进细胞增殖,抑制细胞凋亡；5.5-FU处理RKO细胞48小时,促使FasL在RNA和蛋白水平高表达；6.miR-21抑制FasL的表达,增加结肠癌RKO细胞对5-FU的化学耐药性,细胞凋亡水平降低,裂解的caspase-3蛋白表达水平降低。以上结果表明,miR-21通过靶向FasL的3’UTR区抑制FasL在mRNA和蛋白水平的表达,从而抑制FasL所参与的信号通路,使结肠癌细胞凋亡水平下降,增加结肠癌RKO细胞对5-FU的化学耐药性。而过表达miR-21或者敲低FasL的表达均会降低细胞凋亡水平,降低RKO细胞对5-FU的敏感性,说明miR-21和FasL都可能成为临床治疗结肠癌的靶点。
【关键词】：miR-21 FasL 五氟尿嘧啶 结肠癌
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第1章 绪论11-21
• 1.1 研究背景11-18
• 1.1.1 MicroRNA的研究进展11-15
• 1.1.2 MiRNA-21在肿瘤细胞中的作用15-16
• 1.1.3 五氟尿嘧啶(5-FU)的作用机制16-18
• 1.1.4 FasL的作用机制18
• 1.2 课题研究的意义及技术路线18-21
• 1.2.1 课题研究的意义18-19
• 1.2.2 课题研究内容及技术路线19-21
• 第2章 MiR-21靶基因的预测及功能富集分析21-28
• 2.1 引言21
• 2.2 实验材料21
• 2.3 实验方法21-22
• 2.4 实验结果22-27
• 2.4.1 保守的miR-21序列22-23
• 2.4.2 预测miR-21的靶基因23-24
• 2.4.3 miR-21靶基因的功能注释分析24-26
• 2.4.4 MiR-21靶基因的KEGG通路分析26-27
• 2.4.5 确定实验用miR-21靶基因27
• 2.5 本章小结27-28
• 第3章 MiR-21靶向FasL抑制结肠癌细胞对5-FU的化学敏感性28-52
• 3.1 实验材料28-31
• 3.1.1 实验细胞28
• 3.1.2 实验试剂28-29
• 3.1.3 实验设备29
• 3.1.4 引物、siRNA及miRNA mimics合成29-31
• 3.2 试验方法31-43
• 3.2.1 结肠癌RKO细胞培养31-33
• 3.2.2 总RNA提取和反转录33-34
• 3.2.3 实时定量PCR34-35
• 3.2.4 细胞转染35-36
• 3.2.5 载体构建36-40
• 3.2.6 细胞活性检测40
• 3.2.7 Western blotting40-42
• 3.2.8 统计学分析42-43
• 3.3 实验结果43-51
• 3.3.1 miR-21潜在靶基因的确定43
• 3.3.2 最可能的潜在的miR-21的靶基因的筛选43-47
• 3.3.3 确定FasL是miR-21的直接靶基因47-48
• 3.3.4 过表达miR-21和干扰FasL表达影响结肠癌细胞对5-FU耐药性48-49
• 3.3.5 miR-21靶向FasL降低5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡49-51
• 3.4 本章小结51-52
• 讨论52-56
• 结论56-58
• 致谢58-59
• 参考文献59-66
• 附录66-67
• 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果67

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本文编号：540045