人结直肠癌相关成纤维细胞和结肠正常成纤维细胞对结直肠癌细胞EMT的影响及机制

发布时间：2017-07-15 23:01

  本文关键词：人结直肠癌相关成纤维细胞和结肠正常成纤维细胞对结直肠癌细胞EMT的影响及机制

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【摘要】：结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,据世界癌症协会2015年的研究表明,结直肠癌的发病率和死亡率仍然高居第三位。虽然针对结直肠癌的化学治疗和靶向治疗已经取得了显著进展,但是仍有60%的手术后病人会发生原位复发和远处转移。因此,只有彻底地弄清结直肠癌转移的机制,才能为结直肠癌的治疗提供新方案。肿瘤微环境不仅为肿瘤的生长提供了充足的营养,而且它可以通过一些信号通路调控结直肠癌细胞发生转移。其中癌相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境的主要成分,它在结直肠癌转移过程中扮演了重要角色。相比于正常的成纤维细胞(NFs), CAFs中33个基因高甲基化,26个基因低甲基化,其表达更高水平的FAP、a-SMA和POSTN等等。目前CAFs到底是通过何种机制促进肿瘤细胞发生转移尚不完全清楚。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在结直肠癌的发生发展中起了重要作用,那么CAFs是不是通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥促肿瘤转移的作用?既然NFs和CAFs细胞基因存在差异,那么NFs对肿瘤细胞Wnt/p-catenin信号通路和其生物学行为又会产生何种影响?本研究将进行初步探讨。首先,我们采用组织块植入法,从人结直肠癌患者的肿瘤组织中分离纯化CAFs,从正常切缘处分离纯化NFs,借助Western Blot和免疫荧光方法进行鉴定。其次,通过免疫荧光、Q-PCR和SA-β-gal染色方法检测细胞活化和衰老程度,结果表明CAFs的活化和衰老程度均要高于NFs。接下来,我们将CAFs与肿瘤细胞共培养,发现肿瘤细胞迁移能力增强,上皮标记E-Cadherin下调,间质标记Vimentin和Fibronectin上调,即促进肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)；同时Wnt/β-catenin信号通路相关因子S552和DVL3的水平上调,表明肿瘤细胞Wnt/β-catenin信号通路活化。用NFs上清条件培养结直肠癌细胞或NFs与肿瘤细胞共培养,肿瘤细胞迁移和侵袭能力下降,E-Cadherin上调,N-Cadherin下调,即NFs抑制肿瘤细胞发生EMT；同时Wnt/p-catenin信号通路相关因子β-catenin和DVL2的表达水平下调,Wnt/β-catenin信号受抑制。进一步研究发现,NFs促进肿瘤细胞Wnt5a表达,同时Wnt/Ca2+通路活化。通过上述实验,我们得到以下结论：1.人结直肠癌相关成纤维细胞活化和衰老程度高于结肠正常成纤维细胞；2.人结直肠癌相关成纤维细胞促进结直肠癌细胞EMT、迁移和Wnt/β-catenin信号通路活化；3.人结肠正常成纤维细胞抑制结直肠癌细胞EMT、迁移和侵袭能力以及Wnt/β-catenin信号通路活化,促进肿瘤细胞增殖,与Wnt5a高表达相关；4.人结肠正常成纤维细胞诱导肿瘤细胞Wnt/Ca2+信号通路激活可能与Wnt5a高表达有关。
【关键词】：结直肠癌 肿瘤-间质相互作用 癌相关成纤维细胞 成纤维细胞 Wnt/β-catenin信号 EMT 原代细胞培养
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 英文缩略语10-14
• 1 引言14-18
• 2 主要的仪器设备和试剂18-30
• 2.1 仪器设备18-20
• 2.2 试剂20-23
• 2.3 所用溶液配方23-30
• 3 材料和方法30-41
• 3.1 实验材料30
• 3.2 实验方法30-41
• 4 结果41-58
• 4.1 原代成纤维细胞的鉴定以及活化、衰老特征比较41-45
• 4.2 CAFs促进结直肠癌细胞EMT作用和机制45-48
• 4.3 NFs抑制结直肠癌细胞EMT的作用和机制48-58
• 5 讨论58-62
• 6 结论62-63
• 参考文献63-67
• 综述67-80
• 参考文献74-80
• 作者简历80-81
• 1 教育背景80
• 2 在读期间取得的科研成果80-81
• 3 在读期间取得的奖励81

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本文编号：546086