PLCE1基因缺失对食管鳞癌细胞侵袭转移的影响

发布时间：2017-07-18 00:09

  本文关键词：PLCE1基因缺失对食管鳞癌细胞侵袭转移的影响

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【摘要】：背景食管癌是人类常见的一种恶性肿瘤,它的发生是一个涉及多因素、多基因的变异积累及相互作用的复杂过程,具有高发病率、高复发率和高死亡率。近来随着大规模临床队列和全基因组关联分析等研究证实磷脂酶Cε1(Phospholipase C Epsilon-1,PLCE1)基因可作为一个食管癌易感基因影响着食管肿瘤的发生发展。但目前对PLCE1在食管癌侵袭转移和发生、发展中的具体作用机制尚不清楚。因此PLCE1的功能性研究对探讨其在食管癌发展进程中的机制具有重要意义。目的探讨PLCE1对食管癌细胞侵袭和转移的影响,分析其与食管癌预后的关系,从而为食管癌的治疗提供新的思路和方法。方法1.运用CRISPR/CAS9基因编辑技术,在食管鳞癌细胞EC-9706的两个保守外显子上设计sgRNA(特异性引导RNA),通过sgRNA的作用将Cas9核酸酶带到基因组的相关具体靶点上,然后对其特定的基因位点进行定点切割,将食管鳞癌中PLCE1基因进行基因敲除。2.通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和Western blotting方法检测突变组(基因敲除)细胞与对照组(未进行基因敲除)细胞中mRNA水平和蛋白水平的表达情况。3.结合划痕、Migration迁移实验和Invasion侵袭实验观察突变组细胞与对照组细胞在迁移、侵袭等方面的表型差异。4.应用裸鼠成瘤实验观察两组移植瘤在移植生长动力学方面的差异。5.应用流式细胞仪检测突变组和对照组细胞的平均荧光强度。6.应用Western blot检测对照组和突变组细胞在基因敲除后其蛋白的表达变化;检测上皮间质转化(EMT)相关转录因子(Snail、β-catenin、Slug、ZO-1)在两组细胞和两组细胞移植瘤中的蛋白表达情况,进而探讨PLCE1与EMT在食管鳞癌预后中的功能性关联。结果1.运用CRISPR/Cas9系统成功将PLCE1基因进行敲除。2.qPCR和Western blotting结果均显示:食管鳞癌易感基因PLCE1在基因敲除之后对照组细胞的mRNA表达水平明显高于突变组细胞(P0.01),且突变组细胞中的PLCE基因的蛋白表达水平完全缺失。3.划痕实验结果表明基因敲除后食管鳞癌细胞的迁移能力明显降低(P0.01);Migration迁移实验结果表明突变组细胞迁移能力相较于对照组细胞显著降低(P0.01),进一步验证划痕结果;Invasion侵袭实验中突变组细胞突破Metrigel胶的侵袭能力显著降低(P0.01)。4.裸鼠成瘤实验的结果说明种植突变组细胞的瘤块体积以及重量均明显低于对照组移植瘤,其生长能力减弱(P0.01)。5.流式细胞仪的平均荧光强度的结果显示EMT中Snail、ZO-1等转录因子在突变组细胞中呈低表达,而在对照组细胞中则呈高表达(P0.001)。6.Western blot技术的结果表明突变组细胞中的蛋白表达缺失;EMT中转录因子Snail在对照组细胞中具有高表达,而在突变型细胞中低表达;突变组移植瘤中Snail等相关转录因子的蛋白表达明显降低,这些结果从蛋白水平上进一步说明了流式细胞仪检测的结果。结论PLCE1基因缺失能够抑制食管鳞癌癌变中的侵袭和转移等发展进程,而EMT在该基因的调控下影响着食管鳞癌的相关功能变化。PLCE1基因与EMT的相互作用将是未来基因研究与基因治疗的新方向。
【关键词】：食管鳞癌 PLCE1 EMT 侵袭 转移
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-20
• 结果20-26
• 讨论26-33
• 小结33-34
• 参考文献34-40
• 综述：PLCE1基因多态性与EMT在肿瘤中的研究进展40-55
• 参考文献49-55
• 附录A55-56
• 附录B56-57
• 攻读学位期间发表文章情况57-59
• 致谢59-60
• 个人简历60

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本文编号：555197