结肠癌细胞系中p53调控癌干细胞表面标志物CD133表达及NU7026的辐射增敏作用研究

发布时间：2017-07-18 09:28

  本文关键词：结肠癌细胞系中p53调控癌干细胞表面标志物CD133表达及NU7026的辐射增敏作用研究

  更多相关文章： 癌干细胞 P53 CD133 DNA-PKcs 结肠癌细胞

【摘要】：目的:以结肠癌细胞系HCT116为主要研究对象,探究p53基因是否调控癌干细胞表面标志物CD133的表达及作用机制,并研究DNA损伤响应调控蛋白DNA-PKcs的抑制剂NU7026对结肠癌干细胞的放射增敏作用。方法:蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹杂交法(western blot),检测细胞系中相关蛋白的表达;以癌干细胞表面标志物CD133/CD44作为标记,通过流式细胞术分别检测p53野生型和p53突变型结肠癌细胞系中的癌干细胞亚群分布比例;实时定量RT-PCR(quantitative Real time-PCR)方法测定CD133和p53基因m RNA转录表达水平;通过瞬时基因转染的方法将sh RNA表达质粒或p53基因真核表达质粒载体转染入细胞,构建干扰p53基因表达或者过表达p53基因的细胞模型;构建CD133启动子启动荧光素酶标记基因表达的重组质粒;用化学发光仪检测CD133启动子转录双荧光素酶活性。将含有高癌干细胞亚群比例的HCT116细胞系分成四个组:实验对照组,20μmol/L NU7026作用组,2 Gyγ射线照射组,20μmol/L NU7026联合2 Gy辐射组,γ射线照射前2小时加入NU7026后,通过细胞克隆形成实验和MTT检测HCT116细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞周期,细胞凋亡,癌干细胞亚群变化,免疫荧光激光共聚焦显微镜观察各组细胞并统计其gH2AX foci点均数等,分析评价NU7026对高癌干细胞亚基比例的结肠癌HCT116细胞系的放射增敏作用及其DNA双链断裂损伤修复反应的影响。结果:首先通过western blot验证了p53野生型结肠癌细胞HCT116p53+/+和p53突变型结肠癌细胞HCT116p53-/-的p53表达状态,确保了实验细胞模型的可靠性;CD133阳性亚群比例,在p53野生型细胞中高达84.84±0.05%,而在p53突变型细胞中只有4.13±0.02%;CD133基因m RNA转录表达检测结果显示,野生型细胞和突变型细胞的相对表达水平分别为0.16±0.041和0.0081±0.0039(t=6.29,P0.01),表明不同p53状态的两HCT116细胞系之间癌干细胞表面标志物CD133的表达水平存在显著差异;在HCT116p53+/+中,通过si RNA干扰技术抑制p53蛋白表达后,CD133转录表达水平也随着下降,CD133阳性亚群比例也下降(从85.78±1.17%降至4.70±0.17%,t=119.79,P0.0001)。抑制p53表达,CD133启动子的转录激活活性也显著下降;在HCT116p53-/-细胞系中过表达外源的p53蛋白,CD133转录表达水平也随之增加,为对照组的1.58倍。CD133启动子转录激活活性明显增加,且具有统计学意义。CD133亚群比例略增(从4.52±0.35%升至5.83±0.30%,t=4.92,P0.01);在293T细胞系中,分别转染p53过表质粒和p53干扰si RNA表达质粒,检测发现CD133启动子活性随p53蛋白的表达量增加而增加,或随p53蛋白表达抑制而减少。在p53野生型结肠癌HCT116细胞试验中,20μmol/L NU7026+2 Gy组与单独2 Gyγ射线辐照组比较,显示出NU7026的放射增敏作用:细胞增殖慢,细胞克隆形成率明显下降(t=7.21,P0.01),存活率降低更加显著(t=7.22,P0.01);照射后24小时G2/M期不可逆阻滞明显增加(t=7.67,P0.01),在48小时,细胞早期凋亡率明显增加(t=8.24,P0.05);作为DNA双链断裂分子标记的细胞gH2AX foci的均数点明显增多;更为重要的是,单独照射后48 h,CD133阳性癌干细胞亚群比例还有所上升,提示癌干细胞更高的辐射抗性,而联合NU7026的处理组,CD133阳性癌干细胞亚群比例降低,有统计学意义。结论:实验发现在结肠癌HCT116细胞中,p53正调控癌干细胞表面蛋白标记物CD133的表达,与对其启动子的转录激活作用有关。NU7026能降低癌细胞受g射线照射后的癌干细胞亚群比例,对癌干细胞为优势亚群的结肠癌HCT116细胞具有明显的放射增敏作用,增敏机制是多方面,包括抑制DNA修复、诱发不可逆G2/M期阻滞、增加细胞凋亡发生。
【关键词】：癌干细胞 P53 CD133 DNA-PKcs 结肠癌细胞
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-20
• 1.1 研究的背景14-18
• 1.1.1 癌干细胞的来源14-15
• 1.1.2 癌干细胞表面标志物15-16
• 1.1.3 癌干细胞的鉴定和筛选16
• 1.1.4 CD133~+/CD44~+ 结肠癌干细胞对治疗的耐受性16-17
• 1.1.5 癌干细胞耐辐射和耐药性机制17
• 1.1.6 P53基因17-18
• 1.1.7 DNA-PKcs18
• 1.2 预实验探索性研究提示18-20
• 第2章 材料与方法20-38
• 2.1 材料20-24
• 2.1.1 实验室常用药品试剂及配方20-21
• 2.1.2 抗体21-22
• 2.1.3 仪器及耗材22-23
• 2.1.4 其他23-24
• 2.2 方法24-34
• 2.2.1 细胞培养及传代处理24
• 2.2.2 蛋白样品的制备24-25
• 2.2.3 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹杂交法25-27
• 2.2.4 QT-PCR实验27-28
• 2.2.5 流式细胞术分析28-29
• 2.2.6 转染实验29-31
• 2.2.7 双荧光素酶-报告基因实验31-34
• 2.3 细胞克隆形成实验34-35
• 2.4 MTT实验35
• 2.5 流式细胞术实验35-37
• 2.5.1 流式细胞仪检测癌干细胞亚群比例35-36
• 2.5.2 细胞周期检测36
• 2.5.3 细胞凋亡检测36-37
• 2.6 免疫荧光激光共聚焦检测γH2AX foci37
• 2.6.1 样品收集及保存37
• 2.6.2 样品处理37
• 2.7 统计学方法37-38
• 第3章 结果38-62
• 3.1 癌干细胞表面标志物CD133蛋白在两细胞系间的差异性38-39
• 3.1.1 两细胞系中 CD133/CD44 癌干细胞亚群比例分析38-39
• 3.1.2 两细胞系中CD133蛋白和mRNA水平表达差异性分析39
• 3.2 p53对癌干细胞表面标志物CD133的调控39-43
• 3.3 CD133启动子生物信息分析及报告基因重组载体43-45
• 3.4 p53基因对CD133启动子转录活性的调节45-48
• 3.5 HCT116细胞系癌干细胞特性48-51
• 3.6 NU7026对HCT116细胞增殖的影响51-53
• 3.7 流式细胞术分析53-58
• 3.7.1 NU7026对CD133阳性亚群比例的影响53-54
• 3.7.2 NU7026对放射诱发HCT116细胞G2/M期阻滞的影响54-56
• 3.7.3 NU7026对放射诱发HCT116细胞凋亡的影响56-58
• 3.8 NU7026对放射诱发HCT116细胞DNA损伤修复的影响58-62
• 3.8.1 NU7026对放射诱发HCT116p53~(+/+)细胞DNA损伤修复的影响58-59
• 3.8.2 NU7026对放射诱发HCT116p53~(-/-)细胞DNA双链断裂损伤修复的影响59-62
• 第4章 讨论62-68
• 4.1 p53基因正向调控CD133启动子活性62-63
• 4.2 DNA-PKcs抑制剂NU7026对结肠癌细胞系γ射线的增敏作用63-68
• 第5章 结论68-70
• 参考文献70-77
• 综述77-88
• 参考文献83-88
• 附录88-92
• 作者攻读学位期间的科研成果92-94
• 致谢94

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本文编号：557076