神经降压素调控肝细胞肝癌上皮间质转化的分子机制探讨

发布时间：2017-07-21 04:09

  本文关键词：神经降压素调控肝细胞肝癌上皮间质转化的分子机制探讨

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【摘要】：目的:探讨神经降压素(neurotensin,NTS)与肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)侵袭性和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系及其相关分子机制。方法:随机选取100例经部分肝切除术治疗的HCC患者石蜡组织切片标本,同时收集患者的临床病理资料。利用免疫组化方法分别检测NTS,Ki67,E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin等EMT指标的表达,并分析NTS与临床病理指标的相关性。以Hep3B、Hep G2为基础,通过基因转染技术和RNA干扰技术构建不同NTR1表达水平的HCC细胞系。利用Brd U增殖实验、MTT法、Annexin V凋亡实验、划痕修复实验、Transwell侵袭实验来观察不同NTS处理和不同NTR1表达水平的细胞在增殖、凋亡、迁移、侵袭上的差异。通过Real-time PCR和Western Blot的方法分析不同处理组之间EMT相关指标(E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Snail、Slug)表达水平上的差异。利用PCR芯片技术和Western Blot探究NTS调控肝癌细胞EMT的主要信号通路和分子机制。通过SR48692和TSW119分别阻断NTS信号通路和经典Wnt通路来观察肝癌细胞EMT指标和侵袭能力的变化。结果:HCC标本中,NTS+标本占19.00%,NTS表达与HCC患者包膜完整性和门静脉癌栓侵润等转移相关指标密切相关。并且NTS+HCC患者预后不良,其OS明显短于NTS-HCC患者,NTS是影响HCC患者不良预后的独立因素。NTS+标本中E-cadeherin表达减少,β-catenin在细胞浆内聚积,N-cadherin表达增多。NTS的表达水平与E-cadeherin的表达水平呈负相关,与β-catenin和N-cadherin的表达水平呈正相关。外源性NTS刺激和高表达NTR1对Hep3B和Hep G2细胞的增殖与凋亡无影响,但可以显著提高其划痕修复率和侵袭细胞数。同时外源性NTS刺激和高表达NTR1可以促进HCC细胞EMT,表现为降低Hep3B和Hep G2细胞中E-cadeherin表达,提高β-catenin、N-cadherin和Snail的表达。给予外源性NTS和提高NTR1表达量可以提高Wnt/β-catenin通路中Wnt1、Wnt3、Wnt5、Axin、p-GSK3β以及β-catenin的表达。SR48692和TSW119阻断可以逆转EMT过程造成E-cadeherin表达升高,β-catenin和N-cadherin表达降低,同时降低Wnt通路中的Wnt3、Axin、p-GSK3β以及β-catenin表达以及HCC细胞的迁移和侵袭力。结论:HCC组织中NTS高表达与肝癌高侵袭和不良预后相关,外源性NTS刺激和高表达NTR1可以通过激活Wnt/β-catenin通路促进HCC细胞发生EMT来增强其侵袭性。
【关键词】：神经降压素 原发性肝细胞肝癌 上皮间质转化 Wnt/β-catenin 通路
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-14
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、HCC组织中NTS的表达及意义14-24
• 1.1 对象和方法14-16
• 1.1.1 病例来源14
• 1.1.2 标本来源14-15
• 1.1.3 免疫组织化学染色试剂15
• 1.1.4 免疫组织化学染色15-16
• 1.1.5 统计学处理16
• 1.2 结果16-22
• 1.2.1 HCC癌组织及癌旁中NTS的表达情况16-17
• 1.2.2 NTS异常表达与患者临床病理指标的相关性17-18
• 1.2.3 NTS异常表达与HCC患者预后的相关性18-19
• 1.2.4 NTS异常表达与HCC细胞增殖和EMT的相关性19-22
• 1.3 讨论22-23
• 1.4 小结23-24
• 二、HCC细胞系中NTS与EMT的相关研究24-54
• 2.1 对象和方法24-36
• 2.1.1 细胞系24
• 2.1.2 细胞培养试剂24
• 2.1.3 细胞转染试剂24-25
• 2.1.4 细胞功能实验试剂25
• 2.1.5 荧光实时定量PCR试剂25
• 2.1.6 Western Blot试剂25
• 2.1.7 ELISA试剂25
• 2.1.8 慢病毒基因转染25-30
• 2.1.9 siRNA转染30
• 2.1.10 细胞功能实验30-32
• 2.1.11 荧光实时定量PCR32-33
• 2.1.12 Western Blot33-35
• 2.1.13 ELISA35-36
• 2.2 结果36-52
• 2.2.1 不同HCC细胞系内NTS和NTR1的表达36-37
• 2.2.2 不同NTR1表达水平的HCC细胞系的构建37-38
• 2.2.3 不同NTR1表达水平的HCC细胞中NTS的分泌量38-39
• 2.2.4 外源性NTS对不同NTR1表达水平的HCC细胞生长的影响39-44
• 2.2.5 外源性NTS对不同NTR1表达水平的HCC细胞侵袭的影响44-48
• 2.2.6 外源性NTS刺激和高表达NTR1促进HCC细胞EMT48-52
• 2.3 讨论52-53
• 2.4 小结53-54
• 三、NTS促进HCC细胞EMT机制探讨54-67
• 3.1 对象和方法54-56
• 3.1.1 细胞系54
• 3.1.2 细胞培养试剂54
• 3.1.3 PCR芯片相关试剂54
• 3.1.4 细胞转导信号通路阻断剂54
• 3.1.5 Western Blot试剂54-55
• 3.1.6 PCR芯片55-56
• 3.1.7 细胞信号阻断实验56
• 3.2 结果56-65
• 3.2.1 外源性NTS刺激和高表达NTR1促进HCC细胞EMT与Wnt通路激活有关56-60
• 3.2.2 SR48692及TWS119对HCC细胞EMT和Wnt/β-catenin通路的影响60-63
• 3.2.3 SR48692及TWS119对HCC细胞侵袭性的影响63-65
• 3.3 讨论65-66
• 3.4 小结66-67
• 结论67-68
• 参考文献68-72
• 发表论文和参加科研情况说明72-73
• 附录73-75
• 综述 神经降压素/白介素8通路影响肿瘤上皮间质转化的研究进展75-89
• 综述参考文献82-89
• 致谢89

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本文编号：571338