P53在非转录依赖凋亡途径中向线粒体迁移机制的研究

发布时间：2017-07-25 21:31

  本文关键词：P53在非转录依赖凋亡途径中向线粒体迁移机制的研究

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【摘要】：为了维持细胞内环境稳定,细胞内基因可以控制细胞自主有序的死亡,这就是细胞凋亡。细胞凋亡是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施,在胚胎发育阶段,细胞凋亡清除已完成使命的细胞,在成年阶段,细胞凋亡清除衰老和病变的细胞,保证机体的健康发育。而恶性肿瘤的发生是因为细胞增殖不受控制,从细胞凋亡的角度来看,正是因为恶性肿瘤的凋亡机制被抑制,导致本应启动凋亡程序的细胞没能被清除。细胞凋亡途径受多种基因调控,其中最重要的调控基因就是p53。p53是重要的抑癌基因,在正常细胞中,当细胞受损时,p53通过不同通路调控细胞周期或DNA修复或诱导凋亡。众多肿瘤细胞研究表明,超过50%的肿瘤细胞中调控诱导细胞凋亡的重要抑癌基因p53发生突变,无法发挥自身调控功能诱导细胞凋亡。因此,研究p53诱导凋亡的机制将是癌症基因治疗的重要方向。本文中主要探究了p53非转录依赖凋亡途径中p53向线粒体迁移的可能机制。利用非细胞体系和细胞瞬转实验,通过镜下观察线粒体破膜和Western Blot检测的方式,从细胞外和细胞内实验两部分验证p53向线粒体迁移的影响因素和可能机制。结果表明,在细胞外,p53可以直接诱导线粒体膜通透性的增加及细胞色素c的释放;在细胞内,胞浆p53蛋白具有自发向线粒体迁移的特点,受到外源刺激时,内源p53蛋白可在6小时内累积并向线粒体迁移,而外源p53蛋白在胞浆内无需上游刺激信号即可在线粒体部位富集,并且p53蛋白的N端结构域及DBD结构域在p53线粒体迁移过程中可能起到重要的调控作用。
【关键词】：P53 线粒体 细胞凋亡
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 提要4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 前言12-20
• 1.1 p53蛋白简介12
• 1.2 p53蛋白的结构12-13
• 1.3 p53蛋白的功能13-15
• 1.3.1 p53参与细胞周期调控14
• 1.3.2 p53参与DNA损伤修复14-15
• 1.3.3 p53与细胞衰老15
• 1.4 p53蛋白与细胞凋亡15-17
• 1.4.1 p53转录依赖凋亡途径16
• 1.4.2 p53非转录依赖凋亡途径16-17
• 1.5 研究意义、拟解决的关键问题及技术路线17-20
• 第2章 p53及其分段的质粒构建20-32
• 2.1 材料与设备20-24
• 2.1.1 表达载体20-22
• 2.1.2 主要试剂22-23
• 2.1.3 主要仪器与设备23-24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 引物设计24
• 2.2.2 p53及其分段质粒的构建24-27
• 2.2.3 相关溶液的配制27-28
• 2.3 结果与分析28-32
• 2.3.1 p53部分截短质粒目的片段的退火温度优化28-29
• 2.3.2 将目的片段构建到pc3.1 载体中29-32
• 第3章 p53蛋白对线粒体的细胞外作用分析32-45
• 3.1 材料与设备32-34
• 3.1.1 主要试剂32-33
• 3.1.2 主要仪器与设备33-34
• 3.2 实验方法34-40
• 3.2.1 转化宿主菌34-35
• 3.2.2 目的蛋白诱导表达条件的优化35-36
• 3.2.3 蛋白的大量表达36
• 3.2.4 Ni柱蛋白纯化36-37
• 3.2.5 Ni柱的重生37
• 3.2.6 考马斯亮兰染色37
• 3.2.7 细胞株37-38
• 3.2.8 细胞培养液配制38
• 3.2.9 胰酶配制38
• 3.2.10 磷酸盐缓冲液（PBS）38
• 3.2.11 细胞冻存及复苏38
• 3.2.12 蛋白浓度测定38-39
• 3.2.13 非细胞体系39-40
• 3.3 结果与分析40-45
• 3.3.1 p53蛋白的原核表达40-41
• 3.3.2 p53蛋白的纯化41-42
• 3.3.3 p53蛋白对线粒体的直接作用42-45
• 第4章 p53在细胞内向线粒体的迁移效应45-56
• 4.1 材料与设备45-47
• 4.1.1 主要试剂45-46
• 4.1.2 主要抗体46
• 4.1.3 主要仪器与设备46-47
• 4.2 实验方法47-51
• 4.2.1 细胞株47
• 4.2.2 细胞培养试剂的配制47-48
• 4.2.3 胰酶配制48
• 4.2.4 磷酸盐缓冲液（PBS）48
• 4.2.5 细胞冻存及复苏48
• 4.2.6 细胞组分分离48-49
• 4.2.7 内源p53蛋白的线粒体迁移49
• 4.2.8 外源p53重组质粒的细胞瞬时转染49-50
• 4.2.9 Western Blot50-51
• 4.3 结果与分析51-56
• 4.3.1 内源p53蛋白的线粒体迁移51-52
• 4.3.2 外源p53的线粒体迁移52-53
• 4.3.3 外源p53全长及片段向线粒体迁移53-56
• 第5章 总结56-59
• 附录59-63
• 参考文献63-70
• 致谢70

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1 Yaffe M;Schatz G;杨剑;;线粒体研究展望[J];国外医学(分子生物学分册);1987年02期

2 杨青;线粒体蛋白质是如何进入线粒体的[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1987年02期

3 Schatz G;Butow RA;王静;;蛋白质如何输入线粒体[J];国外医学(分子生物学分册);1984年01期

4 郑斌娇;梁敏;薛凌;郑静;张婷;龚莎莎;方芳;吕建新;管敏鑫;;线粒体相关的疾病治疗及干预策略[J];生命科学;2012年02期

5 王s，

本文编号：573383