TWEAK通过外泌体介导巨噬细胞对卵巢癌转移调控的研究

发布时间：2017-07-25 21:37

  本文关键词：TWEAK通过外泌体介导巨噬细胞对卵巢癌转移调控的研究

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【摘要】：第一部分TWEAK通过外泌体途径介导巨噬细胞抑制上皮性卵巢癌的转移目的:探讨TWEAK是否可通过外泌体途径介导巨噬细胞对上皮性卵巢癌转移的调控作用。方法:1.PMA诱导人单核细胞系THP-1为贴壁的巨噬细胞,TWEAK刺激巨噬细胞24h后抽提外泌体,透射电镜观察其形态;2.将THP-1来源的巨噬细胞分泌的外泌体用PKH67(green fluorescent membrane linker-dye)染料标记,染料标记后的外泌体刺激上皮性卵巢癌细胞株SKOV3 12h,DAPI染核后,用激光共聚焦显微镜观察荧光的分布和强度;3.分别将PBS、巨噬细胞分泌的外泌体、TWEAK刺激后巨噬细胞分泌的外泌体与上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910PM共培养48h后,通过transwell实验检测其迁移、侵袭能力。结果:透射电镜可见巨噬细胞分泌的外泌体呈圆形,直径在30-100nm;激光共聚焦显微镜结果示,PKH67标记的外泌体主要分布在胞质,尤其围绕核周分布;Transwell实验结果示,与PBS空白对照组相比,巨噬细胞分泌的外泌体可提高卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,而tweak刺激巨噬细胞后,其分泌的外泌体则可降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。结论:THP-1来源的巨噬细胞分泌的外泌体可被卵巢癌细胞内化,TWEAK可通过外泌体途径逆转巨噬细胞对上皮性卵巢癌的促转移作用。第二部分分析TWEAK作用前后巨噬细胞释放的外泌体包裹的mi RNA的表达谱,明确差异表达的mi RNA目的:明确TWEAK作用前后巨噬细胞释放的外泌体中差异表达的mi RNA方法:用PMA诱导人单核细胞THP-1为巨噬细胞后,将TWEAK(0,200ng/ml)分别作用于巨噬细胞24小时后,取上清液抽提外泌体,沉淀后抽提RNA,用agilent人的mi RNA芯片进行差异谱检测。结果:芯片结果示TWEAK作用于巨噬细胞后,巨噬细胞释放的外泌体中有55种mi RNA表达上调,17种mi RNA表达下调。文献报道证实有功能的表达上调的mi RNA有15种,其中包括mir-7、mir-148a、mir-140、mir-625等,表达下调的mi RNA有4种。结论:TWEAK作用前后巨噬细胞释放的外泌体中包裹的mi RNA表达谱有差异,并选择mir-7作为继续研究的对象。第三部分研究TWEAK作用后巨噬细胞释放的外泌体运输mi RNA抑制上皮性卵巢癌转移的机制目的:探究TWEAK作用后巨噬细胞释放的外泌体通过传递mi RNA抑制上皮性卵巢癌转移的具体机制。方法:1.PMA诱导人单核细胞系THP-1为贴壁的巨噬细胞,TWEAK刺激巨噬细胞24h后抽提外泌体,分别将PBS、巨噬细胞分泌的外泌体、TWEAK刺激后巨噬细胞分泌的外泌体与上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910PM共培养;2.共培养24h后分别提取两细胞株的RNA,采用Real-time PCR方法检测TWEAK刺激前后,巨噬细胞分泌的外泌体作用后上皮性卵巢癌细胞系中mir-7的表达情况;3.共培养48h后分别提取两细胞株的蛋白质,采用Western Blot方法检测上皮性卵巢癌细胞株中EGFR蛋白的表达情况,及其下游信号通路AKT和ERK蛋白的磷酸化及非磷酸化的表达情况。结果:Real-time PCR结果示TWEAK作用于巨噬细胞后,其分泌的外泌体与SKOV3、HO-8910PM细胞株共培养24h后,两卵巢癌细胞株中mir-7的表达水平高于TWEAK作用前;Western Blot结果示TWEAK作用于巨噬细胞后,其分泌的外泌体与SKOV3、HO-8910PM细胞株共培养48h后,两卵巢癌细胞株中EGFR蛋白表达下调,且其下游信号通路AKT和ERK蛋白的磷酸化水平也降低,而总的AKT和ERK的表达则没有改变。结论:TWEAK作用于巨噬细胞后,其分泌的外泌体可上调上皮性卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910PM中mir-7的表达,下调mir-7靶蛋白EGFR的表达及其下游AKT和ERK信号通路的活化。
【关键词】：TWEAK 外泌体 微小RNA 卵巢癌 巨噬细胞 转移
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 缩略词表13-14
• 前言14-21
• 第一部分 TWEAK通过外泌体途径介导巨噬细胞抑制上皮性卵巢癌的转移21-37
• 引言21-22
• 材料与方法22-31
• 结果31-35
• 讨论35-37
• 第二部分 分析TWEAK作用前后巨噬细胞释放的外泌体包裹的miRNA的表达谱，明确差异表达的miRNA37-55
• 引言37-38
• 材料与方法38-46
• 结果46-52
• 讨论52-55
• 第三部分 研究TWEAK作用后巨噬细胞释放的外泌体运输miRNA抑制上皮性卵巢癌转移的机制55-71
• 引言55-56
• 材料与方法56-65
• 结果65-69
• 讨论69-71
• 结论71-72
• 参考文献72-81
• 致谢81-85
• 硕士期间发表及待发表的学术论文目录85

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本文编号：573429