米非司酮对人脑胶质瘤U251细胞活性的作用及机理的研究

发布时间：2017-07-27 16:22

  本文关键词：米非司酮对人脑胶质瘤U251细胞活性的作用及机理的研究

  更多相关文章： 胶质瘤 米非司酮 18kDa转运蛋白 线粒体凋亡

【摘要】：目的米非司酮(Mifepristone,RU486)是由人工合成的一种19-去甲类固醇激素,能够有效的和孕酮受体、糖皮质激素受体结合,并对上述激素有很强的拮抗作用,是临床上一种常见的甾体类抗孕激素药物。近期研究发现,米非司酮对肿瘤的生长有较好的抑制作用,而其对孕酮和糖皮质激素拮抗效应也受到了广泛关注。然而,米非司酮对肿瘤的作用机制仍存在很大的争论。正常体内孕酮激素和糖皮质激素合成在线粒体完成,原料为胆固醇,通过线粒体膜表面的18 kDa转位分子蛋白(18 kDa translocator protein,TSPO),转运至线粒体内,合成孕酮和糖皮质激素。此过程中,TSPO的数量和活性对于孕酮和糖皮质激素合成起到至关重要的作用,反过来,体内孕酮和糖皮质激素浓度对TSPO也存在负反馈作用,即孕酮和糖皮质激素浓度高,负反馈调节TSPO表达下降,活性降低,从而减少胆固醇运输,减少孕酮和糖皮质激素合成,反之亦然。TSPO是线粒体凋亡途径(Mitochondrial apoptosis pathway)中关键调节蛋白,激活后可通过启动细胞凋亡,在肿瘤生长过程中发挥抑制作用。因此,本研究的假说为:米非司酮通过抑制孕酮和糖皮质激素活性,减少孕酮和糖皮质激素对TSPO负反馈作用,增加TSPO表达及活性,通过线粒体凋亡途径,增加细胞凋亡,抑制肿瘤生长。本实验通过米非司酮对人脑胶质瘤细胞系U251体外实验研究,探讨米非司酮是否对U251细胞株具有抑制细胞增殖活性作用,并观察米非司酮对U251细胞凋亡的影响和TSPO、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的变化,初步探讨米非司酮诱导U251细胞凋亡的相关作用机制,为新型抗肿瘤药物研发提供基础实验依据。方法第一部分使用CCK-8微板比色法检测不同浓度的米非司酮(2.5、5、10、20、40μmol/L)组中U251细胞活性,台盼兰染色法检测细胞死亡率。第二部分根据第一部分的实验结果,选取米非司酮5、10、20 umol/L三个浓度组,通过Hoechst33258染色、流式细胞仪检测U251细胞凋亡,采用蛋白印迹法和免疫荧光染色法检测U251细胞中TSPO,Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达。结果第一部分细胞活性检测结果显示:与对照组比较,5、10、20、40(μmol/L)米非司酮组细胞存活率明显降低,且与药物浓度成正比,有统计学意义(P0.05)。低浓度米非司酮(2.5μmol/L)组对细胞存活率影响不明显,与对照组相比无统计学意义(P0.05)。死亡细胞检测结果显示:米非司酮组U251细胞死亡率较对照组均有所增加,且与药物浓度成正比。但当米非司酮浓度增加至20、40μmol/L时,各组间抑制作用已无明显差异。第二部分细胞凋亡检测显示,与对照组相比,米非司酮组细胞凋亡率增加明显,且一定范围内与药物浓度成正比,其中10μmol/L米非司酮浓度组TSPO的表达增加最明显(P0.05)。凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在米非司酮各浓度组中均有表达,其中20μmol/L浓度组Bcl-2蛋白表达明显低于对照组(P0.05),而Bax、Caspase-3蛋白表达在20μmol/L浓度组中明显高于对照组(P0.05)。结论(1)米非司酮在适当浓度范围内对胶质瘤U251细胞有增殖抑制作用,促进细胞凋亡的作用;(2)米非司酮对胶质瘤U251细胞有促凋亡作用,其机制可能与促进TSPO表达,启动线粒体凋亡途径有关。
【关键词】：胶质瘤 米非司酮 18kDa转运蛋白 线粒体凋亡
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中英文缩写对照词表6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 引言12-18
• 参考文献14-18
• 第一部分 米非司酮对胶质瘤U251细胞增殖的影响18-28
• 1 材料19-21
• 1.1 实验细胞19-20
• 1.2 主要试剂20
• 1.3 主要仪器20-21
• 1.4 主要试剂配制21
• 2 方法21-23
• 2.1 细胞培养21-22
• 2.2 CCK-8 微板比色法检测细胞活性22-23
• 2.3 台盼兰染色法检测细胞死亡率23
• 2.4 统计学分析23
• 3 结果23-25
• 3.1 细胞活性检测结果23-24
• 3.2 死亡细胞检测结果24-25
• 4 讨论25-26
• 参考文献26-28
• 第二部分 米非司酮诱导胶质瘤U251细胞凋亡及机理28-46
• 1 材料29-31
• 1.1 实验细胞29
• 1.2 主要试剂29-30
• 1.3 主要仪器30-31
• 1.4 主要试剂配制31
• 2 方法31-35
• 2.1 细胞培养31
• 2.2 Hoechst33258染色法观察细胞核染色形态31-32
• 2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI双标法)32
• 2.4 免疫细胞化学染色法及免疫印迹法检测TSPO蛋白表达32-34
• 2.5 免疫印迹法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达34-35
• 2.6 统计学分析35
• 3 结果35-42
• 3.1 凋亡细胞核形态检测结果35
• 3.2 细胞凋亡率检测结果35-37
• 3.3 细胞TSPO蛋白表达检测结果37-39
• 3.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3 凋亡相关蛋白表达检测结果39-42
• 4 讨论42-43
• 参考文献43-46
• 综述46-64
• 参考文献55-64
• 致谢64-65
• 攻读硕士期间发表的论文65

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本文编号：582312