p53缺失型HL-60白血病细胞中核干细胞因子下调对p73的影响

发布时间：2017-08-03 08:16

  本文关键词：p53缺失型HL-60白血病细胞中核干细胞因子下调对p73的影响

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【摘要】：目的:本课题组前期通过基因芯片技术阐明了抑制Nucleostemin表达后P53缺失型白血病细胞株HL-60全基因组表达谱改变情况,利用生物信息学筛选出了其中与NS下调变化最相关的几条信号通路,其中PI3K/AKT/m TOR通路在基因和蛋白水平已被证实,后续的研究证明m TOR介导的自噬也可能参与其中,但目前的研究仅仅表明PI3K/AKT/m TOR通路与NS非P53依赖信号通路密切相关,其上下游节点特别是上游节点并不清楚,P73作为P53家族的一员,结构和功能与P53都很相似且其在肿瘤细胞中极少发生突变,被认为是一种潜在的抑癌基因,其是否有可能参与NS非P53依赖信号通路,目前未见文件记载。为了验证P73是否参与NS非P53依赖信号通路,本研究探讨了P53缺失型HL-60白血病细胞中核干细胞因子下调对P73的影响,从而为这一推论提供依据。方法:(1)用慢病毒载体NS-si RNA-GV248和其它两种辅助包装原件共同转染293T细胞,进行病毒的包装及滴度测定。(2)在96孔板上以不同MOI值(MOI=50,MOI=100,MOI=150)的慢病毒转染HL-60细胞,每孔接种100μl培养液,细胞密度约为5×104,确定慢病毒感染HL-60细胞的合适MOI值。(3)确定合适MOI值后,用制备好的慢病毒载体转染Hl-60细胞,通过荧光倒置显微镜、实时荧光定量PCR及Western Blot确定转染效率和NS下调程度。(4)分别在0小时、48小时、72小时、96小时观察慢病毒转染后阴性对照组和试验组内HL-60细胞△Np73、TAp73、NS在基因和蛋白水平上的表达情况。(5)对数据分析采用SPSS19.0软件,数据以均值±标准差(X±S)表示,多组样本间的比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Bonferroni法,校正检验水准α=0.0167.结果:(1)将沉默NS基因的慢病毒载体NS-RNAi-GV248转染293T细胞,在其胞内进行包装、浓缩,检测病毒滴度为4×108TU/ml。(2)当MOI值≥100时,倒置显微镜观察转染效率均达80%以上,MOI=100或150两者相差不大,本次实验选择MOI=100。(3)Real-time PCR结果显示:NS表达下调后,实验组在0小时、48小时、72小时、96小时,△Np73基因表达量逐渐减低,TAp73基因表达量逐渐增加,与阴性对照组比较有统计学意义。(4)Western blot结果显示:NS表达下调后,实验组在0小时、48小时、72小时、96小时,△Np73蛋白表达量逐渐减低,TAp73蛋白表达量逐渐增加,与阴性对照组比较有统计学意义。结论:(1)下调NS的表达使△Np73在基因和蛋白水平表达量减低,TAp73在基因和蛋白水平表达量增加,且与时间相关。(2)NS变化引起P73变化,提示P73可能参与了NS非P53依赖信号通路,从而为进一步研究NS非P53依赖性通路打下基础。
【关键词】：nucleostemin 非P53依赖性通路 慢病毒载体 △Np73 TAp73
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7;R730.43
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文缩略词11-12
• 引言12-14
• 1 实验材料14-19
• 1.1 细胞系14
• 1.2 引物序列14
• 1.3 载体14-15
• 1.4 主要试剂及耗材15-16
• 1.5 主要仪器16-17
• 1.6 主要试剂配制17-18
• 1.7 主要分析软件18-19
• 2 实验方法19-26
• 2.1 细胞培养19-20
• 2.2 细胞总RNA提取20
• 2.3 RNA浓度、纯度检测20-21
• 2.4 荧光定量PCR检测21-22
• 2.5 重组慢病毒NS-RNAi-GV248感染HL-60细胞22-23
• 2.6 Real-time PCR测定不同目的基因的表达情况23-24
• 2.7 Western blot测定不同目的基因蛋白水平表达情况24-26
• 3 结果判断26-28
• 3.1 Real-time PCR结果计算26
• 3.2 Western blot结果判断26
• 3.3 统计学处理26-28
• 4 结果28-34
• 4.1 慢病毒载体感染HL-60细胞最适MOI值确定28
• 4.2 转染六孔板培养的HL-60细胞28-29
• 4.3 Real-timePCR检测不同时间点NS在基因水平上的表达情况29
• 4.4 Western blot检测不同时间点NS在蛋白水平上的表达情况29-30
• 4.5 6 孔板培养HL-60细胞转染不同时间点凋亡情况30-31
• 4.6 Real-timePCR检测不同时间点TAp73和△Np73在基因水平的表达情况31-32
• 4.7 Western blot检测不同时间点TAp73和△Np73在蛋白水平上的表达情况32-34
• 5 讨论34-38
• 5.1 NS与P53、P73之间的关联性34-36
• 5.2 NS与P73、MDM2之间的关联性36-37
• 5.3 NS与P73、P21之间的关联性37-38
• 6 结论38-39
• 参考文献39-44
• 综述 核干细胞因子的研究进展44-64
• 参考文献55-64
• 个人简历64-65
• 致谢65

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本文编号：613365