急性早幼粒白血病细胞中全反式维甲酸对UBA3表达的调控作用与机制

发布时间：2017-08-06 11:25

  本文关键词：急性早幼粒白血病细胞中全反式维甲酸对UBA3表达的调控作用与机制

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【摘要】：背景:急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一种较为罕见的疾病,是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一种特殊类型。它是目前人们认识最清楚的恶性肿瘤之一,同时也是唯一一个能够通过靶向疗法治愈的恶性肿瘤。20世纪70年代,蒽环类药物的疗法让一些APL病人得到治愈,但易导致DNA损伤。直到1985年全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)的引入提升了这些病人的治疗反应,并使这种疾病的预后获得了革命性的进步。临床试验中,结合ATRA的现代治疗方法使得超过90%的病人脱离治疗并无病生存五年以上。ATRA在体内和体外均可诱导APL细胞迅速分化为粒细胞,并且临床上ATRA只需三到五周就能使APL病人缓解。ATRA发挥治疗作用的机制一直是研究的热点,至今尚未完全阐明。NEDD8(neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8)是近年来研究比较热的多种类泛素蛋白中的一种,是一个仅包含81个氨基酸的小分子蛋白质,其与相应底物共价结合的过程称为Neddylation。β淀粉样蛋白前体蛋白结合蛋白1(amyloid-βprecursor protein binding protein 1,APPBP1)与类泛素修饰活化酶3(ubiquitin-like modifier activating enzyme 3,UBA3)结合而成的异二聚体构成Neddylation的活化酶E1,而UBA3在其中作为催化亚基,对Neddylation修饰的正常进行至关重要。经典的NEDD8底物是cullins,主要参与细胞周期和凋亡的调控;介导cullins发生Neddylation的E3连接酶是Rbx1(RING box protein 1),生成的Neddylated cullins(约90-100k Da)增强相应酶复合体的活性。已有研究证明,肿瘤的发生发展很可能与Neddylation修饰系统的异常有关。NEDD8活化酶E1的特异性抑制因子MLN4924已经在多种实体瘤和白血病中显示具有很好的治疗效果,进入临床II期研究。因此,靶向Neddylation修饰系统有望为未来癌症治疗带来新的曙光。已有研究表明,Neddylation促进AML细胞的生存和增殖,但是还不清楚Neddylation对APL细胞的分化有无影响,及在ATRA的治疗效应中具有怎样的作用。为解答上述科学问题,我们开展了本课题研究。目的:在APL细胞中探索Neddylation参与ATRA治疗作用的机制;探讨ATRA对UBA3表达的调节作用及分子机制;探索UBA3在APL细胞恶性生长中的作用及分子机制;探索APL治疗的新靶点。方法:为了研究ATRA对UBA3表达的调节作用,以ATRA处理APL细胞系HL60及NB4细胞,通过Western Blot(WB)检测Neddylation相关蛋白水平指标Neddylated cullins、UBA3及APPBP1的表达,通过实时荧光定量PCR(QPCR)检测UBA3的m RNA表达水平。为了研究ATRA调节UBA3表达的分子机制,用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂E64d/pepstatin A处理NB4及HL60细胞,WB检测UBA3及Neddylated cullins的水平;用ATRA处理HL60及NB4细胞后,WB检测自噬指标LC3BII的表达情况;用自噬诱导剂rapamycin处理HL60及NB4细胞后,WB检测LC3BII、UBA3及Neddylated cullins的表达情况。为研究Neddylation系统在APL细胞恶性生长中的作用及其可能机制,通过NEDD8活化酶E1抑制剂MLN4924处理或者以短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)敲低UBA3抑制Neddylation,进行细胞生长曲线分析和软琼脂集落形成实验分析检测对恶性生长的影响;凋亡检测和细胞周期分析探讨影响恶性生长的机制;流式细胞仪检测表面Marker CD11b和吉姆萨染色揭示对APL细胞未分化状态的影响。为分析经典底物在其中的作用,我们用携带Rbx1 sh RNA的慢病毒感染HL60细胞,引起内源性Rbx1的表达沉默进而导致cullins Neddylation的减弱,并通过上述方法观察其对HL60细胞生长曲线、凋亡、细胞周期进程、形态及CD11b表达的影响。结果:1)ATRA抑制UBA3的表达WB检测ATRA处理APL细胞株HL60及NB4细胞0d、1d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表达结果显示:随着作用时间的延长,UBA3的表达量逐渐降低,表明ATRA能够抑制APL细胞中UBA3的表达,并且呈时间依赖性。QPCR检测ATRA处理HL60细胞0d、2d、3d、4d、5d后的UBA3的表达结果显示:随着时间的延长,UBA3的m RNA水平却呈上升趋势,因此在ATRA处理APL细胞时,UBA3的蛋白水平与其m RNA水平的变化是相反的,提示UBA3表达量的下降可能是蛋白稳定性下降。2)ATRA通过诱导自噬抑制UBA3的表达,进而抑制Neddylation。蛋白酶体抑制剂MG132处理HL60细胞不能逆转ATRA诱导的UBA3表达量下降,提示UBA3的下降不是通过蛋白酶体介导的。溶酶体抑制剂E64d/pepstatin A在HL60细胞里比较好的逆转ATRA诱导的UBA3蛋白量下降,而且在NB4细胞中也有部分的逆转,提示ATRA是通过溶酶体途径诱导UBA3蛋白量下降的。ATRA处理HL60及NB4细胞后,自噬指标LC3BII上升,证实了ATRA能够诱导自噬;而自噬诱导剂rapamycin处理HL60及NB4细胞后,UBA3及Neddylated cullins指标均下降,提示ATRA通过诱导自噬增强溶酶体活性进而减弱UBA3蛋白的表达量。3)UBA3及其介导的Neddylation促进APL细胞生长、存活及细胞周期进程,并维持其未分化状态。通过MLN4924处理或者敲低UBA3抑制Neddylation,进行如下分析:?生长曲线分析表明,MLN4924处理或者敲低UBA3均能够显著抑制HL60及NB4细胞的生长;软琼脂集落形成实验分析表明MLN4924能够显著抑制HL60及NB4细胞的集落形成能力。?凋亡检测和细胞周期分析表明MLN4924处理或者敲低UBA3均能够显著促进HL60及NB4细胞的凋亡、诱导细胞周期进程阻滞。?吉姆萨染色结果表明MLN4924处理或者敲低UBA3均能够使HL60及NB4细胞胞浆染色变浅、浆核比增加及胞浆空泡增多;表面Marker CD11b检测结果分析表明MLN4924处理或者敲低UBA3均能够诱导HL60及NB4细胞CD11b表达增加。因此,UBA3及其介导的Neddylation促进APL细胞生长、存活及细胞周期进程,并维持其未分化状态。4)UBA3及其介导的Neddylation通过经典底物促进APL细胞的恶性生长。敲低Rbx1后,生长曲线分析表明HL60细胞的生长受到显著抑制;凋亡检测表明HL60细胞的凋亡增加;细胞周期进程分析表明HL60细胞周期进程阻滞在G0/G1期;吉姆萨染色结果表明HL60细胞胞浆染色变浅、浆核比增加及胞浆空泡增多;CD11b表面Marker检测结果分析表明HL60细胞CD11b表达显著增加。因此,敲低Rbx1以减弱cullins Neddylation具有和抑制整体Neddylation类似的效应,提示Neddylation通过经典底物cullins促进APL细胞的恶性生长。结论:ATRA通过诱导自噬抑制UBA3的表达,进而抑制Neddylation。UBA3及其介导的Neddylation促进APL细胞生长、存活及细胞周期进程,并维持其未分化状态。对Neddylation的抑制作用是ATRA具有显著治疗效应的重要机制。敲低Rbx1以减弱cullins Neddylation具有和抑制UBA3类似的效应,提示Neddylation通过经典底物cullins促进APL细胞的恶性生长。本文创新点:1)发现ATRA抑制UBA3表达。2)发现对Neddylation的抑制作用是ATRA具有显著治疗效应的重要机制。3)发现Rbx1可能是APL治疗的新靶点。
【关键词】：APL ATRA Neddylation
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-14
• 英文缩略词表14-15
• 前言15-19
• 材料与方法19-35
• 1 实验材料19-22
• 1.1 实验细胞株19
• 1.2 主要实验试剂19-20
• 1.3 主要实验仪器设备20-21
• 1.4 常用试验试剂的配制21-22
• 2 实验方法和步骤22-35
• 2.1 ATRA在APL细胞中对UBA3表达的调节作用22-29
• 2.2 ATRA在APL细胞中调节UBA3表达的分子机制29-30
• 2.3 UBA3在APL细胞恶性生长中的作用及机制30-34
• 2.4 UBA3影响APL细胞恶性生长的分子机制探讨34-35
• 实验结果35-44
• 1 ATRA在APL细胞中对UBA3表达的调节作用35-36
• 1.1 WB检测ATRA在HL60细胞中对UBA3表达的调节作用的结果35
• 1.2 WB检测ATRA在NB4细胞中对UBA3表达的调节作用的结果35-36
• 1.3 QPCR检测ATRA对APL细胞中UBA3 m RNA水平的影响的结果36
• 2 ATRA在APL细胞中抑制UBA3表达的分子机制36-39
• 2.1 WB检测蛋白酶体途径和溶酶体途径在ATRA调节UBA3表达中的作用36-38
• 2.2 WB检测自噬途径在ATRA调节UBA3表达中的作用分析结果38-39
• 3 UBA3在APL细胞恶性生长中的作用及机制39-42
• 3.1 集落形成及生长曲线实验检测UBA3对APL细胞恶性生长的影响39-40
• 3.2 流式细胞术探讨UBA3影响APL细胞恶性生长的机制40-41
• 3.3 吉姆萨染色和流式细胞术揭示对APL细胞未分化状态的影响的结果41-42
• 4 UBA3影响APL细胞恶性生长的分子机制的检测结果42-44
• 讨论44-48
• 1 ATRA在APL细胞中对UBA3表达的调节作用44-45
• 2 ATRA在APL细胞中抑制UBA3表达的分子机制45-46
• 2.1 蛋白酶体途径和溶酶体途径在ATRA调节UBA3表达中的作用分析45
• 2.2 自噬途径在ATRA调节UBA3表达中的作用分析45-46
• 3 UBA3在APL细胞恶性生长中的作用及机制46-47
• 3.1 UBA3对APL细胞恶性生长的影响46
• 3.2 UBA3影响APL细胞恶性生长的机制46
• 3.3 UBA3对APL细胞未分化状态的影响46-47
• 4 UBA3影响APL细胞恶性生长的分子机制47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 综述55-70
• 参考文献61-70
• 硕士期间发表论文70-71
• 致谢71-73

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本文编号：629673