改良人的垂体瘤培养以及Il-6对垂体腺瘤垂体功能紊乱的影响

发布时间：2017-08-06 23:09

  本文关键词：改良人的垂体瘤培养以及Il-6对垂体腺瘤垂体功能紊乱的影响

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【摘要】：第一部分：改良人的垂体瘤培养研究背景垂体腺瘤是一类具有内分泌功能的肿瘤,其发病率在颅内肿瘤中仅次于胶质瘤和脑膜瘤。按肿瘤直径大小分类,茎1cm者称为微腺瘤；1-4 cm为大腺瘤；4 cm为巨大腺瘤。而巨大垂体腺瘤常常累及单侧甚至双侧海绵窦区域,通过神经外科手术完全切除且保护其相应神经功能完整性,相对困难,此时需要借助药物或立体定向反射治疗,方能达到治疗目的。而垂体腺瘤根据病理类型分类可分为：生长激素(GH)细胞腺瘤；催乳素(PRL)细胞瘤；促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞腺瘤；促甲状腺素(TSH)细胞腺瘤；促性腺激素(LH/FSH)细胞腺瘤；混合性腺瘤；无分泌功能的细胞腺瘤7种。泌乳素腺瘤和生长激素腺瘤目前尚存在有效药物可以进行内科治疗,但其他类型垂体腺瘤,尤其是无功能型垂体腺瘤,尚没有有效药物。因垂体腺瘤为良性肿瘤,生长缓慢,原代培养困难,一方面是,因为垂体腺瘤的生长可能与肿瘤细胞与正常垂体细胞之间激素的支持环境有关,在体外培养脱离了垂体所在的门脉系统血供的支持以及激素的影响,可能影响了垂体腺瘤的生长。另一方面,因人垂体瘤培养体系内常常混有大量成纤维细胞,垂体腺瘤的生长要求较成纤维细胞高,在培养一段时间后,培养体系内大量的成纤维细胞甚至取代垂体瘤细胞。并且经过多年的研究,人垂体瘤细胞系的建立举步维艰,Jin等利用SV40病毒,通过转染的方式,尝试建立人垂体瘤细胞系HP75,但该细胞系仅保留了部分垂体瘤细胞的特性,并未得到广泛应用。在过去的几十年里,全世界学者针对垂体瘤的基础研究模型主要使用的是大鼠的垂体瘤细胞系GH3, ATT20等[2-6]。长期,稳定,高纯度的人垂体腺瘤培养方式一直是众多学者的研究目标。对于垂体瘤培养的研究,国外研究主要有Ilona Fazekas等学者,多年培养垂体腺瘤细胞并总结不同类型的垂体腺瘤培养的特点,其中生长激素型腺瘤和促肾上腺型腺瘤相对培养较易,而泌乳素型腺瘤和无功能性腺瘤相对培养较困难。GH腺瘤,ACTH腺瘤及嗜酸性干细胞腺瘤贴壁,迁移及生长较好。PRL腺瘤和无功能性腺瘤活性较差。迁移缓慢而罕见,贴壁非常慢,且细胞核不规则,胞浆内细胞器不良,激素分泌颗粒较小。Ishiwata等学者认为在培养过程中成纤维细胞难以和垂体腺瘤细胞完全分离,若不分离成纤维细胞,则成纤维细胞呈优势生长,逐渐取代培养体系内的垂体腺瘤细胞,导致培养失败。但同时也有学者认为,成纤维细胞最初对垂体瘤细胞起着一个滋养层的作用但最终会限制垂体瘤细胞的生长。如何抑制成纤维细胞一直是垂体瘤培养研究领域的热点。对于这一问题Auda-Boucher G等人尝试利用含有D-valine的培养液进行培养,从而抑制成纤维细胞的生长。国内研究主要有徐伟光和寿雪飞等学者对垂体瘤培养方式的研究,大部分学者都主张将垂体腺瘤用多聚赖氨酸等方式,粘附于培养皿底部,单层培养,因单层培养在换液过程中不易造成细胞的损失,并且细胞平铺于培养皿底部,有利于观察细胞形态和结构。但将垂体腺瘤用多聚赖氨酸粘附于培养皿底部,出现成纤维细胞时,难以将二者分离,无法实现最大程度抑制成纤维细胞的目的。垂体腺瘤起源于外胚层,属上皮来源,而成纤维细胞常起源于中胚层的间质起源组织。细胞角蛋白常表达于上皮来源的细胞或组织,在角质细胞中主要为骨架蛋白。其功能一方面是维持上皮组织结构的完整及连续性,另一方面与上皮的增殖分化有密切关系。研究发现,细胞角蛋白具有较高的组织分化特异性及保守性,有研究表明细胞角蛋白在20多种上皮来源的细胞中阳性表达。波形蛋白常表达于间质来源的细胞中,并且几乎所有正常的间质细胞中均存在波形蛋白的表达。波形蛋白的主要功能是一方面在应急损伤中有重要作用,另一方面,波形蛋白具有较强的弹性和灵活性,能够弥补微管及肌动蛋白所不具备的弹性,所以,波形蛋白还具有维持细胞组织结构完整性的功能。在波形蛋白基因敲除的小鼠实验中,因波形蛋白不表达,虽然小鼠机体功能运转正常,但因波形蛋白缺失导致脂蛋白转运障碍。当出现这种转运障碍时,细胞内无法累积脂蛋白,因这个过程需要机构功能完整的中间丝网参与。并且波形蛋白在肾上腺细胞中也有重要作用,可以完成肾上腺中低密度脂蛋白生成胆固醇酯的过程。传统垂体瘤细胞培养研究,大多都首先将悬浮生长的垂体瘤细胞变为贴壁生长,再进行后续的增殖与传代。但是这样的平面2D培养体系并不能很好的模拟实体肿瘤的微环境,Bissel MJ的团队认为2D平面培养会让培养的细胞丧失许多信号通路,在培养过程中尽可能还原细胞自然结构,对细胞间信号交换至关重要。在体内,实体肿瘤在3D空间下可以无限增殖,并且在细胞与细胞间,细胞与细胞外基质间信号交换活跃,细胞生长存在极性,自发聚集,而在传统的体外培养体系中,细胞大多都贴附与培养皿底面,单层培养,细胞与细胞间,细胞与细胞基质间的信号交换仅来自一个平面,细胞生长形成无极性的细胞群,无法反映体内的真实情况。研究目的和意义针对垂体腺瘤培养的两个难题,1.尽量去除培养体系内的成纤维细胞。2.培养稳定增殖并保持良好功能的垂体腺瘤细胞,改良人的垂体腺瘤培养方式,结合国内外研究经验,克服已有细胞系的不同种属的影响；能更好的模拟天然人体内的肿瘤性状。尽可能去除培养体系内成纤维细胞,并还原细胞生长自然结构,促进细胞间信号交换,在体外环境中保持细胞的良好功能,寻找长期,稳定,高效的垂体瘤培养方法,为垂体瘤相关实验如：肿瘤发生发展,药物作用靶点,内分泌功能恢复潜力,提供人的垂体瘤细胞作为实验材料。垂体腺瘤经原代培养后,通过测定CK和Vimentin的表达,确定所培养的垂体腺瘤细胞仍保持上皮细胞的特性,稳定增殖,并保持功能。研究方法利用神经外科自2014年11月至2015年6月拟诊为垂体瘤的新鲜手术标本36例,术后病理证实均为垂体腺瘤,其中生长激素型腺瘤8例,泌乳素型腺瘤10例,卵泡刺激素型腺瘤8例,无功能型腺瘤10例。本研究通过医院伦理委员会同意,入组对象均签署知情同意书。根据文献报道和自己的经验,针对培养体系内随着时间增长,不断增殖的成纤维细胞,将反复差速贴壁法纯化后的垂体腺瘤细胞悬浮种植于24孔板内,并使用含有右旋颉氨酸的DMEM D-valin进行培养,培养过程中如发现有贴壁生长的成纤维细胞,立即换孔,继续培养。经过多次分离,最终培养体系内成纤维细胞被最大程度去除。并且我们保持垂体腺瘤培养过程中的悬浮特性,一方面可以方便分离垂体腺瘤与成纤维细胞,另一方面,在培养基的液态环境里,垂体瘤细胞之间有天然的聚集倾向,更有利于细胞与细胞间的信号交换。通过观察细胞镜下形态、细胞免疫荧光化学染色以及细胞增殖实验对原代细胞进行鉴定。结果1.经改良后的培养方法培养出的垂体瘤细胞悬浮在培养基中,有聚集趋势,透亮且折光性强,原代培养传代成功28例(77.78%)。最少存活15天,最长存活112天,平均生存41.81天,并能稳定传代并保持良好的功能最长5代。2.增殖实验显示,细胞在体外仍具有较好的增殖和分裂的能力。3.经免疫荧光化学染色鉴定,原代培养的垂体腺瘤细胞,上皮来源的细胞标记物细胞角蛋白(cytokeratin,CK)呈阳性；而间质来源的细胞标记物波形蛋白(Vimentin)则呈阴性。4.免疫印迹实验(Western-Blot)提示原代培养的垂体腺瘤细胞,上皮来源的细胞标记物细胞角蛋白(cytokeratin,CK)呈阳性；而间质来源的细胞标记物波形蛋白(Vimentin)则呈阴性。结论1.各类型垂体腺瘤细胞均有不易贴壁,悬浮生长,且有聚集倾向的特点。2.因垂体腺瘤呈悬浮或半贴壁生长,而成纤维细胞呈贴壁生长,利用这一特性,定期反复运用差速贴壁法,更换培养皿,可以最大限度的减少垂体腺瘤培养体系中的成纤维细胞,达到纯化垂体腺瘤细胞的目的。3.因垂体腺瘤天然具有悬浮生长并具备聚集倾向,保持垂体腺瘤的悬浮生长特性有利于垂体瘤细胞间信号传递,稳定传代并保持良好的功能。第二部分IL-6对垂体腺瘤垂体功能紊乱的影响研究背景垂体功能紊乱(Pituitary Dysfunction)是一种多病因导致的慢性内分泌障碍疾病。垂体功能紊乱表现各异,呈隐匿性发病,发病率与死亡率和激素分泌水平及激素升高或缺乏程度相关。垂体功能紊乱最常见的病因为颅内肿瘤,以鞍区肿瘤最常见(如,垂体腺瘤,颅咽管瘤),鞍旁肿瘤次之(如,鞍旁脑膜瘤,视神经胶质瘤),再次为颅内转移瘤(如,乳腺癌脑转移,肺癌脑转移,黑色素瘤脑转移)。一般情况下都是由于增大的肿瘤压迫垂体或垂体病,或因鞍内压力增高导致垂体血供障碍,从而引发垂体功能紊乱。但一般此类情况发病的垂体功能紊乱病情进展缓慢,除非病人发生肿瘤卒中,一旦发生卒中,垂体功能紊乱的病情可在数小时到数天恶化。垂体腺瘤为第三大好发的颅内肿瘤,约占颅内肿瘤10%。国内统计发病率约为1/10万,其年发病率女性为70/100万人,男性为28/100万人,尸检发现率约为20%-30%。而泌乳素腺瘤则是最常见的垂体功能性腺瘤,约占所有垂体功能性腺瘤的40%-60%[25]。垂体腺瘤主要从以下几个方面危害人体：1.垂体激素过量分泌引起一系列的代谢紊乱和器官功能损害；2.肿瘤压迫使其它垂体激素水平低下,引起相应靶腺体的功能低下；3.压迫鞍区结构,如视交叉、视神经、海绵窦、脑底动脉、下丘脑、第三脑室,甚至累及额叶、颞叶、脑干等,导致相应功能的严重障碍[26]。对于有内分泌功能的腺瘤,一般认为患者的临床症状主要取决于肿瘤的内分泌功能,比如泌乳素细胞腺瘤的临床症状以闭经泌乳症状为主。但是临床发现很多以闭经泌乳症状求诊的患者,甚至部分内分泌检查也显示血浆泌乳素水平高的患者,最终病理证实为非泌乳素细胞腺瘤；或者病理证实为泌乳素细胞腺瘤的患者并无闭经泌乳症状。Molitch[27]等通过对1224例垂体微腺瘤患者研究发现,术后早期有872例血浆PRL水平降至正常,但术后1年内有21%的患者PRL水平再次升高。白细胞介素6(IL-6)不仅参与免疫调节,还有调节内分泌的作用。IL-6可以作用于垂体腺,胎盘等器官,调节激素的分泌。在大鼠垂体中,IL-6可以刺激滤泡分泌,从而导致泌乳素(PRL)和生长激素(GH)增加。在人胎盘中,IL-6刺激绒毛膜促性腺激素的释放,这在结构和功能上与黄体生成素(LH)相类似。研究目的及意义根据既往的研究发现炎症因子在垂体功能紊乱中有重要作用,我们通过实验探讨炎症因子在垂体瘤垂体功能紊乱中的作用及机制,控制垂体瘤炎症可能有利于内分泌紊乱的治疗。同时针对IL-6的靶向治疗可能未来垂体瘤垂体功能紊乱治疗的新靶点。研究方法通过收集2014年11月至2015年6月25例拟诊垂体腺瘤并伴有垂体功能紊乱的患者血浆。本研究通过医院伦理委员会同意,入组对象均签署知情同意书。我们利用液相悬浮生物芯片的检测方式,对比垂体瘤伴垂体功能紊乱患者外周血中8种常见炎症因子的释放情况。我们用释放明显增高的IL-6在多种剂量下刺激人泌乳素腺瘤细胞,通过ELISA分析检测IL-6与肿瘤细胞激素的分泌关系,并探究其潜在的机制。结果1.IL-6在垂体腺瘤伴垂体功能紊乱患者外周血中明显升高将25例垂体腺瘤外周血样本和3例正常健康人的外周血样本纳入实验检测,垂体腺瘤伴内分泌功能紊乱外周血中炎症因子释放水平存在明显增高的是IL-6,并存在统计学差异。2.IL-6浓度和泌乳素腺瘤激素分泌相关不同浓度的重组白介素6(rhIL-6)干预泌乳素腺瘤细胞48小时后,对泌乳素腺瘤细胞泌乳素分泌有明显的促进作用,与对照组相比,泌乳素分泌增加,在500单位/ml浓度下,P0.05,随着药物浓度增加,促进泌乳素分泌的效应越强,有一定的剂量依赖效应。3.多巴胺受体激动剂可以减弱IL-6诱导泌乳素分泌的效应溴隐亭联合IL-6干预泌乳素腺瘤细胞48小时后,IL-6诱导的泌乳素腺瘤细胞泌乳素分泌有抑制作用,与对照组相比,泌乳素分泌增加,与IL-6组相比,泌乳素分泌减少。结论1.IL-6可能是引起垂体腺瘤内分泌功能紊乱的原因之一我们通过对比25例垂体腺瘤外周血样本和3例正常健康人的外周血样本,我们发现IL-6呈明显的高释放,并有统计学差异。并且将重组白介素6 (rhIL-6)作用于人泌乳素垂体腺腺瘤,发现在随着rhIL-6浓度增加,泌乳素分泌相应增加,并且在rhIL-6浓度达到500U/ml时存在统计学差异。2.IL-6诱导泌乳素腺瘤激素分泌的效应可以被多巴胺受体激动剂拮抗通过在培养体系内加入溴隐亭我们发现,重组白介素6(rhIL-6)刺激泌乳素腺瘤细胞分泌泌乳素的效应被减弱了,说明溴隐亭在激动多巴胺受体的同时,还可以拮抗IL-6对泌乳素腺瘤细胞的刺激,进而减少泌乳素的释放,从而达到治疗泌乳素腺瘤的目的。
【关键词】：垂体瘤 细胞培养 细胞系 炎症因子 垂体功能紊乱 激素
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R736.4
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 第一部分 改良人的原代垂体瘤培养方法23-43
• 一、材料与方法23-30
• 1.1 标本来源23
• 1.2 取材方法23-24
• 1.3 培养方法24-28
• 1.4 垂体瘤鉴定28-30
• 二、结果30-36
• 2.1 垂体瘤原代培养来源基本资料及培养情况30-32
• 2.2 垂体瘤细胞形态学观察32-35
• 2.3 原代培养垂体腺瘤细胞鉴定35-36
• 三、讨论36-43
• 第二部分 IL-6对垂体功能紊乱的影响43-61
• 一、材料与方法43-52
• 1 研究对象43-44
• 2 液态悬浮芯片检测炎症因子44-49
• 3. ELISA检测不同浓度人重组IL-6对泌乳素腺瘤激素分泌的影响49-50
• 4. ELISA测定在溴隐亭作用下IL-6对泌乳素腺瘤分泌泌乳素的影响50-52
• 5. 数据分析52
• 二、结果52-56
• 1. IL-6在垂体腺瘤伴垂体功能紊乱患者外周血中明显升高52-53
• 2. IL-6浓度和泌乳素腺瘤激素分泌相关53-55
• 3. 多巴胺受体激动剂可以减弱IL-6诱导泌乳素分泌的效应55-56
• 三、结论56
• 四、讨论56-61
• 参考文献61-65
• 致谢65-67
• 攻读学位期间发表的文章67-69

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