miR-24抑制BCL2L11表达促进胃癌生长的机制研究

发布时间：2017-08-07 21:38

  本文关键词：miR-24抑制BCL2L11表达促进胃癌生长的机制研究

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【摘要】：研究背景和目的:胃癌的发病率高,预后差,潜在发病机制尚未完全阐明。作为一种异质性比较强的实体肿瘤,胃癌治疗靶点的选择困难重重。细胞凋亡贯穿肿瘤发生发展的整个过程,凋亡通路异常可能在恶性肿瘤发病机制中发挥重要作用,但目前其具体机制仍不明。BCL2L11作为BCL2家族的一员,是线粒体凋亡通路中的重要分子。在包括肿瘤在内的多种疾病中,BCL2L11表达发生异常。Micro RNA(miRNA)通过负向调控靶基因表达参与肿瘤发生发展及化疗耐药等多个病理过程。本课题组前期研究发现了胃癌中异常的miRNA表达谱,且与患者预后相关。但其具体的调控机制仍在探索中。本课题旨在研究BCL2L11表达异常在胃癌发病中的调控机制,筛选影响BCL2L11表达的上游miRNA,并探索miRNA-BCL2L11信号通路对胃癌增殖、凋亡等生物学行为的影响。研究方法:1.靶点预测:通过生物信息学软件筛选出BCL2L11可能是miR-24的靶基因。2.组织实验:胃癌组织中miR-24与BCL2L11的表达分析。收集胃腺癌组织及其配对的癌旁正常组织,用Western Blot及RT-q PCR检测组织中BCL2L11的含量;用Taqman探针法检测miR-24表达水平。3.体外实验:验证miR-24-BCL2L11信号通路对胃癌细胞生物学行为的影响。(1)利用荧光素酶报告基因验证miR-24与BCL2L11的调控关系。(2)利用miR-24类似物/抑制剂(mimics/inhibitors)使SGC7901细胞中miR-24上调/下调后,验证对BCL2L11的调控作用。(3)用功能学实验(CCK8增殖实验、transwell、划痕实验及细胞凋亡实验)验证miR-24对胃癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。(4)同时过表达BCL2L11及miR-24,验证miR-24对胃癌增殖的影响。(5)利用si RNA下调BCL2L11的表达,进一步验证BCL2L11的功能。4.体内实验:验证miR-24-BCL2L11信号通路对肿瘤生长的影响。裸鼠腋下植瘤(SGC7901过表达BCL2L11组、SGC7901过表达miR-24组、对照组),4周后处死小鼠,取出肿瘤。测量肿瘤大小及重量,检测组织中BCL2L11及miR-24表达水平。研究结果:1.组织实验:与癌旁正常组织相比,胃癌组织中BCL2L11的蛋白水平较低,但m RNA水平无明显变化,说明某种转录后调控机制影响BCL2L11的表达。基于miRNA的转录后调控作用,经生物信息学软件筛选得出BCL2L11可能为miR-24的靶基因。进一步验证胃癌组织中miR-24的表达水平,结果发现相较于癌旁正常组织,胃癌组织中miR-24呈显著高表达。2.体外实验:(1)荧光素酶报告基因结果显示miR-24可直接与BCL2L11的3’UTR区结合。(2)在SGC7901细胞中转染miR-24 mimics/inhibitors后,细胞中miR-24表达水平上调/下调。Western Blot结果证实miR-24上调后,BCL2L11的蛋白水平下降;miR-24下调后BCL2L11的蛋白水平升高。RT-q PCR结果显示其m RNA水平无明显变化。(3)功能学实验证实miR-24可促进胃癌细胞的增殖和迁移,抑制其凋亡。(4)在SGC7901细胞中同时过表达BCL2L11及miR-24,BCL2L11过表达可以部分削弱miR-24促进增殖的能力。(5)转染si RNA可显著抑制SGC7901细胞中BCL2L11的表达。BCL2L11下调后,细胞增殖加快,凋亡减少。3.体内实验:miR-24过表达组的肿瘤生长较快,并且其BCL2L11蛋白表达水平明显下降,但m RNA水平无明显变化。Mi R-24可以通过抑制BCL2L11的表达抑制体内肿瘤生长。研究结论:胃癌组织中miR-24高表达,BCL2L11低表达。体内和体外实验均证实在胃癌中,miR-24可以通过抑制BCL2L11表达促进肿瘤的生长。
【关键词】：胃癌 miR-24 BCL2L11 增殖 凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-16
• 研究现状、成果11-15
• 研究目的、方法15-16
• 对象和方法16-34
• 1.1 实验材料16-17
• 1.1.1 组织标本16
• 1.1.2 细胞系16
• 1.1.3 裸鼠16
• 1.1.4 常规试剂和耗材16-17
• 1.1.5 实验所需主要抗体17
• 1.2 各实验所需主要试剂及配置17-20
• 1.2.1 细胞培养所需试剂17-18
• 1.2.2 Western Blot所需主要试剂18-19
• 1.2.3 RT-qPCR所需主要试剂19
• 1.2.4 荧光素酶报告基因实验所需主要试剂19
• 1.2.5 细胞功能学实验所需主要试剂19-20
• 1.3 主要实验仪器20
• 1.4 主要实验方法20-32
• 1.4.1 细胞培养20-23
• 1.4.2 蛋白提取23
• 1.4.3 总RNA提取23-24
• 1.4.4 Western blot24-26
• 1.4.5 mRNA的定量检测26-27
• 1.4.6 miRNA的定量检测27-29
• 1.4.7 荧光素酶报告基因实验29
• 1.4.8 功能学实验29-32
• 1.4.9 小鼠成瘤实验32
• 1.5 统计学分析32-34
• 结果34-48
• 2.1 胃癌组织中BCL2L11低表达，，miR-24高表达34-36
• 2.1.1 胃癌组织中BCL2L11的表达分析34-35
• 2.1.2 靶点预测35-36
• 2.1.3 胃癌组织中miR-24的表达分析36
• 2.2 荧光素酶报告基因实验证实BCL2L11是miR-24的靶基因36-38
• 2.3 miR-24参与BCL2L11的转录后调控38-39
• 2.4 miR-24对胃癌细胞生物学行为的影响39-42
• 2.4.1 miR-24对胃癌细胞增殖能力的影响40
• 2.4.2 miR-24对胃癌细胞迁移能力的影响40-41
• 2.4.3 miR-24对胃癌细胞凋亡的影响41-42
• 2.5 BCL2L11过表达可以部分削弱miR-24促增殖的能力42-44
• 2.6 BCL2L11下调可促进胃癌细胞的增殖，抑制其凋亡44-45
• 2.7 miR24BCL2L11信号通路对体内肿瘤生长的影响45-48
• 2.7.1 miR-24过表达促进体内肿瘤生长45-46
• 2.7.2 miR-24可通过抑制BCL2L11的表达促进肿瘤生长46-48
• 讨论48-53
• 结论53-55
• 参考文献55-64
• 发表论文和参加科研情况说明64-65
• 综述 miRNA在胃癌中的研究进展65-77
• 综述参考文献71-77
• 致谢77-78
• 个人简历78

本文编号：636859