Connexin43过表达对U251细胞生长迁移及凋亡作用的研究

发布时间：2017-08-09 20:35

  本文关键词：Connexin43过表达对U251细胞生长迁移及凋亡作用的研究

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【摘要】：缝隙连接是相邻细胞间的直接连接，细胞质可以通过缝隙连接通道直接联系在一起。缝隙连接直接调解代谢产物、离子从一个细胞运输到另一个细胞内。缝隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）在中枢神经系统星型胶质细胞中高表达，而最常见的星形细胞瘤中的表达常常是降低的。有研究认为Cx43表达的降低将会有利于胶质瘤细胞的生长。本研究在建立胶质瘤U251过表达Cx43基础上，通过细胞增殖实验，细胞迁移实验（Migration assay），，RT-PCR（Reversetranscription，PCR）和Western Blot等实验方法，分析Cx43对胶质瘤U251在生长，迁移和凋亡方面的作用和影响。为胶质瘤的治疗及耐药机制的研究提供新的思路和方法。 1．Cx43对细胞生长的影响 U251和Cx43过表达U251细胞分别计数，10%FBS+IMDM培养基种植到24孔板，培养7天，每隔24h消化细胞，取均值进行细胞计数。实验结果发现，U251和Cx43-U251细胞在4-5天时生长迅速，在6-7天时细胞生长趋于平缓。两种细胞在1-4天时生长差别不大，在5-7天时U251细胞增殖远大于Cx43-U251细胞具显著差异。 实验结果表明，过表达Cx43对U251细胞增殖具有一定的影响。Cx43对U251细胞生长的抑制作用有可能与细胞周期调解蛋白相关。 2. Cx43对细胞迁移的影响 本部分实验拟检测Cx43对胶质瘤细胞迁移能力的影响。划痕实验显示，Cx43过表达U251细胞在修复划痕过程中细胞的运动性更有方向性（指向性），正常U251细胞在划痕修复时间和细胞运动性上与Cx43过表达U251具有显著差别。观察发现，Cx43过表达U251细胞划痕处迁移过程中细胞自身形态发生改变。与U251细胞相比，Cx43过表达U251细胞骨架更为伸展，由多角形变为狭长的梭形。 实验结果表明，Cx43过表达可以促使细胞更快修复划痕，增强了细胞迁移能力。脑胶质瘤的浸润性生长是临床治疗难点，Cx43有可能是通过与细胞骨架蛋白之间相互作用来影响细胞迁移。 3. Cx43对细胞凋亡的影响 目前对胶质瘤的治疗多采用手术、放化疗综合治疗方案。TMZ因为具良好疗效而被广泛使用。实验证明1000uM TMZ诱导胶质瘤发生凋亡。为进一步阐述Cx43是否参与TMZ诱导胶质瘤凋亡，采用U251和Cx43过表达U251细胞组，检测了Cx43，Caspase-3，Bcl-2和Bax的表达水平。实验结果显示: Cx43过表达组U251Bax/Bcl-2比值远低于U251组比值，具统计学差异（p0.05）。Cx43过表达U251细胞中Bcl-2表达增多，Bax表达降低，Bax/Bcl-2比率显著降低；Cx43过表达U251细胞中Caspase-3表达明显降低。结果表明，Cx43可能是通过线粒体通路影响细胞凋亡。 综上所述，Cx43具有可抑制U251细胞的增殖，促进细胞迁移，抵抗由TMZ诱导细胞凋亡的作用。
【关键词】：缝隙连接蛋白43 胶质瘤 迁移 凋亡
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文词表8-11
• 第1章 文献回顾11-28
• 1.1 中枢神经系统肿瘤的形成星形细胞瘤11-12
• 1.2 缝隙连接蛋白家族12-17
• 1.2.1 缝隙连接（GJIC，Gap junction intercellular communiction）12-13
• 1.2.2 缝隙连接蛋白的基因结构13-17
• 1.3 Cx43 的生物学特性17-27
• 1.3.1 Cx43(GJA1)17-18
• 1.3.2 Cx43 结构特点18-19
• 1.3.3 Cx43 在人胶质瘤细胞中的表达19
• 1.3.4 Cx43 在肿瘤发生中的作用机制19
• 1.3.5 Cx43 对细胞生长的作用19-22
• 1.3.6 Cx43 对细胞迁移作用22-25
• 1.3.7 Cx43 对凋亡的作用25-27
• 1.4 本课题研究目的和内容27-28
• 1.4.1 研究目的27
• 1.4.2 具体内容27-28
• 第2章 材料与方法28-39
• 2.1 实验细胞28
• 2.2 实验试剂28-29
• 2.3 实验仪器29-30
• 2.4 试剂配置30-31
• 2.5 实验方法31-39
• 2.5.1 细胞培养及稳转细胞系构建31-32
• 2.5.2 Cx43 对 U251 细胞增殖的影响32
• 2.5.3 Cx43 过表达对 U251 细胞迁移及细胞形态学的影响32-33
• 2.5.4 检测替莫唑胺 Cx43 过表达 U251 细胞凋亡作用的研究33-38
• 2.5.5 TUNEL 检测凋亡38
• 2.5.6 统计学分析38-39
• 第3章 实验结果39-49
• 3.1 Cx43 过表达对 U251 细胞增殖的影响39-41
• 3.2 Cx43 过表达对 U251 细胞迁移能力的影响41-42
• 3.3 Cx43 过表达 U251 细胞在替莫唑胺诱导的凋亡机制中产生的影响42-49
• 3.3.1 MTS 检测细胞增殖42-44
• 3.3.2 RT-PCR 检测 U251 及过表达 Cx43 U251 细胞 mRNA 表达情况44-46
• 3.3.3 Western Blot 检测 Cx43 过表达 U251 细胞凋亡相关蛋白表达情况46-48
• 3.3.4 TUNEL 检测凋亡48-49
• 第4章 讨论49-52
• 第5章 结论52-53
• 参考文献53-64
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果64-65
• 致谢65

【共引文献】

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2 张贝贝;何春晓;宋正波;娄广媛;余新民;赵s

本文编号：647209