1基因转化牛胎儿成纤维细胞优化脂肪酸组份的研究

发布时间：2016-08-25 00:21

本文关键词：动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用，由笔耕文化传播整理发布。

《西北农林科技大学》 2010年

慢病毒载体介导线虫sfat-1基因转化牛胎儿成纤维细胞优化脂肪酸组份的研究

王嘉力

【摘要】： 多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids,PUFAs)是指化学结构中含有两个或两个以上不饱和烯键的长链脂肪酸。近年来随着对PUFAs生理学作用和细胞学功能研究的深入以及在医药学领域和营养学领域应用的开发, PUFAs已经成为脂肪酸研究领域中新兴的热点。ω-6 PUFAs和ω-3 PUFAs是PUFAs家族中最主要的成员,它们在机体的新陈代谢、信号转导及免疫调节等生理活动中起着非常重要的作用。ω-3脂肪酸脱氢酶(ω-3 Fatty Acid Desaturase)是存在于极少数动植物体内、以ω-6 PUFAs为底物催化生成相应ω-3 PUFAs的一种去饱和酶,编码这种酶的基因称为ω-3脂肪酸脱氢酶基因(ω-3 Fatty Acid Desaturase Gene)。本实验使用密码子替换法优化线虫Caenorhabditis.briggsae的ω-3脂肪酸脱氢酶基因sfat-1并用化学合成法在体外合成该基因。利用两端含有重叠碱基序列的若干个寡核苷酸短片段和相应引物在PCR体系中连接扩增,再经过酶切连接进而合成总长度为1200bp的目的片段。将化学合成的sfat-1基因和表达载体pcDNA3.1(-)进行连接后转染大肠杆菌感受态细胞DH5α,经LB平板筛选阳性克隆、提取质粒和酶切鉴定后进行测序用以验证目的基因的克隆。将ω-3脂肪酸脱氢酶基因sfat-1连接于慢病毒载体共转染HEK293T细胞构建携带目的基因的重组慢病毒pGCLV-sfat1-GFP,同时构建空白慢病毒pGCLV-GFP为实验对照组。慢病毒载体经过酶切、连接和包装后进行收集、纯化浓缩、滴度测定及生物安全性检测。用所获得重组慢病毒pGCLV-sfat1-GFP和慢病毒pGCLV-GFP转化中国西门塔尔牛胎儿成纤维细胞并测定慢病毒最佳MOI,观察并检测牛胎儿成纤维细胞内绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达随细胞培养时间变化,提取细胞总RNA进行RT-PCR验证sfat-1基因的表达,使用重组慢病毒感染细胞后对细胞脂肪酸进行提取和成分分析。实验结果表明:使用密码子替换法和PCR化学合成法能够在体外合成线虫Caenorhabditis.elegans的ω-3脂肪酸脱氢酶基因sfat-1;通过使用携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体介导线虫sfat-1基因感染中国西门塔尔牛胎儿成纤维细胞能够稳定且高效地表达融合蛋白sfat1-GFP;由sfat-1基因编码的ω-3脂肪酸脱氢酶在牛胎儿成纤维细胞中能够有效地催化多种ω-6 PUFAs转变为相应的ω-3 PUFAs,使二者比例由原来的15.32:1变为0.83:1,并且在牛胎儿成纤维细胞中产生更加丰富的超长链ω-3 PUFAs。本研究阐述了优化牛胎儿成纤维细胞内脂肪酸成分的有效方法,证明了优化后的线虫ω-3脂肪酸脱氢酶基因sfat-1在动物体细胞内的作用,为在实验和临床研究中制备转基因动物提供了一定的依据。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S823
【目录】：

摘要6-8

ABSTRACT8-12

第一章文献综述12-20

1.1 多不饱和脂肪酸和脂肪酸脱氢酶12-15

1.1.1 多不饱和脂肪酸12-14

1.1.2 多不饱和脂肪酸脱氢酶基因的研究14-15

1.2 逆转录病毒和慢病毒载体15-17

1.2.1 逆转录病毒的分类及特征15-16

1.2.2 慢病毒载体的应用与发展16-17

1.3 转基因动物的研究17-19

1.3.1 转基因动物的研究进展17

1.3.2 转基因牛的研究进展17-18

1.3.3 转基因动物产品和食品的安全性评价及其展望18-19

1.4 本研究的目的和意义19-20

第二章线虫 sfat-1 的化学合成和慢病毒载体的构建20-29

2.1 材料与方法20-24

2.1.1 菌株与质粒20

2.1.2 主要试剂与药品20

2.1.3 主要仪器与设备20

2.1.4 线虫sfat-1 的化学合成和PCR 拼接20-23

2.1.5 慢病毒载体的构建和连接23-24

2.2 结果24-28

2.2.1 sfat-1 基因化学合成和的PCR 拼接24-25

2.2.2 合成sfat-1 基因克隆及验证25

2.2.3 慢病毒载体的构建25-27

2.2.4 慢病毒颗粒的生产27-28

2.3 讨论28-29

2.3.1 化学合成法PCR 拼接合成sfat-128

2.3.2 慢病毒的包装与扩增28-29

第三章中国西门塔尔牛胎儿成纤维细胞的体外培养29-34

3.1 材料与方法29-30

3.1.1 实验动物29

3.1.2 主要试剂、药品和溶液的配置29

3.1.3 主要实验仪器和设备29

3.1.4 中国西门塔尔牛胎儿成纤维细胞原代培养及传代培养29-30

3.2 结果30-32

3.2.1 牛胎儿成纤维细胞原代培养30-31

3.2.2 牛胎儿成纤维细胞传代培养31-32

3.3 讨论32-34

3.3.1 牛胎儿成纤维细胞的原代培养32

3.3.2 牛胎儿成纤维细胞的传代培养及纯化培养32-33

3.3.3 牛胎儿成纤维细胞的冷冻和复苏33-34

第四章 sfat-1 基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达34-43

4.1 材料和方法34-36

4.1.1 主要试剂药品34

4.1.2 主要实验仪器和设备34

4.1.3 慢病毒MOI（Multiplication Of Infection）的确定34

4.1.4 慢病毒介导sfat-1 基因转化效率的检测34-35

4.1.5 细胞总RNA 提取和 RT-PCR 的鉴定35

4.1.6 免疫印迹分析35

4.1.7 牛胎儿成纤维细胞脂肪酸的提取与GC/MS 分析35-36

4.2 结果36-40

4.2.1 慢病毒最佳MOI 测定36-37

4.2.2 绿色荧光蛋白的观察37

4.2.3 细胞总RNA 提取和RT-PCR 鉴定37-38

4.2.4 Western Blotting 免疫印迹杂交分析38-39

4.2.5 牛胎儿成纤维细胞脂肪酸的提取及GC/MS 分析39-40

4.3 讨论40-43

4.3.1 慢病毒转染细胞后GFP 表达异常41

4.3.2 慢病毒最适MOI 测定的意义41

4.3.3 脂肪酸成分分析41-43

结论43-44

参考文献44-49

附录49-56

致谢56-57

作者简介57

下载全文更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库前8条

1 潘登科;陈红星;冯书堂;李奎;邓继先;;富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪制备的关键技术研究[J];中国畜牧兽医;2007年05期

2 伍金华;周克元;;调节食物中ω-6和ω-3脂肪酸合适比例研究的进展[J];国外医学(卫生学分册);2006年02期

3 龚国春,戴蕴平,樊宝良,朱化彬,王海平,王莉莉,方昌阁,万荣,刘颖,李荣,李宁;以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎[J];中国科学(C辑:生命科学);2003年06期

4 潘登科;张莉;周艳荣;冯冲;龙川;刘晓;董恩球;王树臣;万荣;张健;陈红星;;体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪[J];中国科学(C辑:生命科学);2009年03期

5 ;农业部已受理9项转基因动物研究申请[J];江西饲料;2007年03期

6 龚国春,戴蕴平,樊宝良,朱化彬,王莉莉,王海平,汤波,刘颖,李荣,万荣,黄银花,李宁;利用体细胞核移植技术生产转基因牛[J];科学通报;2003年24期

7 朱贵明;陈宏;周艳荣;卢建申;吴晓洁;陈红星;邓继先;;来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析[J];生物工程学报;2006年05期

8 朱贵明;陈宏;卢建申;周艳荣;吴晓洁;陈红星;邓继先;;应用PCR-酶切连接法合成全长sFat1基因[J];遗传;2006年09期

【共引文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 张卫红;闫军;冯冲;龙川;张兆旺;潘登科;;运输温度与时间对猪孤雌胚胎发育的影响[J];安徽农业科学;2009年13期

2 杨慧婷;王洪梅;孙涛;高运东;仲跻峰;何洪彬;;动物转基因研究进展[J];现代农业科技;2011年02期

3 沈静侠;姜达;;癌性恶病质相关因子及EPA在癌性恶病质中的作用[J];癌症进展;2007年04期

4 黄雅琼;杨素芳;谭世俭;石德顺;;克隆技术的研究进展、存在的问题及应用前景[J];中国牛业科学;2008年02期

5 黄永震;贺花;陈宏;;动物转基因技术研究新进展及其在牛育种上的应用[J];中国牛业科学;2011年04期

6 于永生;罗晓彤;曹阳;张立春;王晓阳;;牛耳皮肤成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因研究[J];河北农业大学学报;2011年04期

7 宋军;王振坤;孔庆然;赵祥杰;刘丽清;田江天;郑重;孙爽;尹智;刘忠华;;利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究[J];东北农业大学学报;2008年03期

8 赵莹;张丽仪;刘昌政;周晓红;;植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成[J];南方医科大学学报;2009年03期

9 索郎拉姆;;转基因技术提高动物生产性能的研究进展[J];动物医学进展;2011年04期

10 李昌庆;苏瑛;;转基因技术在动物育种中的研究进展[J];广东农业科学;2010年04期

中国重要会议论文全文数据库前9条

1 陆凤花;石德顺;韦英明;韦精卫;潘红平;杨素芳;;供体细胞来源对水牛体细胞核移植效果的影响[A];第三届广西青年学术年会论文集（自然科学篇）[C];2004年

2 李裕强;张涌;;我国动物胚胎工程技术的产业化战略分析[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

3 陆敏;许黎明;黄青山;;重组溶葡萄球菌酶在鲜牛奶中的稳定性分析[A];首届中国兽药大会动物药品学暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008学术年会论文集[C];2008年

4 袁玉国;丁国梁;安礼友;赵俊辉;曹玉娟;缪明星;成勇;;转染乳腺上皮细胞为供核细胞制备克隆羊[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第五届全体会议第十次学术研讨会论文集[C];2009年

5 薛振华;潘登科;肖炜;罗学明;朱振营;王晓凤;杨宇泽;谷传慧;云鹏;;利用体细胞核移植技术生产优秀公猪[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

6 李鸿辉;冯冲;王宁;闫军;龙川;郑道山;李西睿;罗学明;朱彦宾;潘登科;;体细胞克隆制备肌肉生长抑制素(Myostatin)基因敲除猪[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）[C];2010年

7 薛振华;肖炜;罗学明;潘登科;;利用体细胞核移植技术生产优秀公猪[A];中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛论文集[C];2010年

8 李海燕;韩萍;穆楠;;动物转基因技术在牛育种中的应用[A];第三届中国牛业发展大会论文集[C];2008年

9 赵桂英;李子良;马文张;和志军;余华;杨国强;连林生;;高黎贡山猪遗传资源现状及展望[A];《2010中国猪业进展》论文集[C];2010年

中国博士学位论文全文数据库前10条

1 李江南;RNA干扰途径抗猪瘟病毒研究[D];吉林大学;2011年

2 张东;转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D];内蒙古农业大学;2011年

3 庞永红;黄牛VEGF、VEGF-B、Flt-1基因遗传变异、克隆与表达研究[D];西北农林科技大学;2011年

4 刘中华;不同茎部长度shRNA对模型小鼠EGFP基因表达干扰的研究[D];西北农林科技大学;2011年

5 吕自力;奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究[D];石河子大学;2011年

6 张艳丽;转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D];南京农业大学;2010年

7 雷安民;山羊-牛异种细胞核移植研究[D];西北农林科技大学;2004年

8 沈伟;ht-PAm在山羊β-casein基因座定位整合与中靶体细胞核移植的研究[D];西北农林科技大学;2004年

9 杨东山;转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究[D];内蒙古大学;2005年

10 徐小明;胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离[D];西北农林科技大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库前10条

1 陈晓瑛;ω-3脂肪酸去饱和酶转基因羊的研究[D];山东农业大学;2011年

2 李栋;Fat-1对人口腔鳞癌细胞影响的研究[D];吉林大学;2011年

3 冯昌波;转基因动物专利研究[D];中国政法大学;2011年

4 马贞丽;风疹病毒E1重组蛋白及其抗原肽在大肠杆菌中的表达[D];暨南大学;2011年

5 孙丹;绵羊成纤维细胞肌肉生长抑制素（Myostatin）基因敲除的初步研究[D];辽宁师范大学;2011年

6 何晓芳;转BMPR-IB基因克隆猪的制备[D];江西农业大学;2011年

7 廖荣荣;转FSH基因克隆猪的制备[D];江西农业大学;2011年

8 高旖旎;青岛地区居民膳食脂肪摄入量及脂肪酸构成与心血管疾病关系的研究[D];山东大学;2011年

9 李全芬;转基因牛基因芯片检测方法的建立[D];南京师范大学;2011年

10 杜珊;山羊乳腺上皮细胞转人β防御素3基因的研究[D];西北农林科技大学;2011年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 潘登科;牟玉莲;潘求真;万荣;刘吉;张莉;冯书堂;;不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎[J];广西农业生物科学;2006年S1期

2 魏东,张学成;微藻脂肪酸去饱和酶及其基因表达的生态调控研究新进展[J];海洋科学;2000年08期

4 张运海,潘登科,孙秀柱,孙国杰,王晓波,刘晓辉,李燕,戴蕴平,李宁;利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎[J];中国科学C辑:生命科学;2005年05期

5 安晓荣,苟克勉,陈永福;体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚[J];科学通报;2001年10期

6 段海清,张兆山,李淑琴,黄翠芬;α-银环蛇毒素基因的合成与表达[J];生物化学与生物物理学报;1999年03期

8 马云肖,王建新;几种新型油脂的脂肪酸组成及特性[J];粮油食品科技;2004年06期

9 朱贵明;陈宏;卢建申;周艳荣;吴晓洁;陈红星;邓继先;;应用PCR-酶切连接法合成全长sFat1基因[J];遗传;2006年09期

10 龚国春,戴蕴平,樊宝良,赵春江,王莉莉,王海平,郑敏,李宁;双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立[J];自然科学进展;2002年12期

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库前2条

1 王嘉力;慢病毒载体介导线虫sfat-1基因转化牛胎儿成纤维细胞优化脂肪酸组份的研究[D];西北农林科技大学;2010年

2 张燕;转sfat-1基因乳腺上皮细胞体外培养研究[D];中国农业科学院;2011年

中国知网广告投放