miR-148a靶向调节基因HK2对乳腺癌细胞糖酵解的影响
发布时间：2024-01-27 11:32
目的研究miR-148a及HK2基因对人乳腺癌细胞糖酵解代谢途径的影响和可能机制。方法荧光定量PCR(qPCR)检测miR-148a在乳腺癌细胞系(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231)中的表达情况;ELISA法检测葡萄糖的摄取量、建立标准曲线检测乳酸的生成量,BrdU法检测增殖情况,Western免疫印迹法检测HK2蛋白水平的变化。通过TargetScan对miR-148a与HK2的作用位点进行预测,并通过双荧光素酶报告实验验证miR-148a与HK2的靶向关系。然后采用CRISPR/Cas9技术敲除乳腺癌MCF-7细胞中HK2基因,观察该细胞对葡萄糖摄取、乳酸生成以及增殖情况。结果miR-148a在MDA-MB231中表达量显著降低(P<0.01);过表达miR-148a使MDA-MB231细胞的葡萄糖摄取量下降1.8倍(P<0.01)、乳酸生成量下降2.4倍(P<0.01),细胞增殖指标下降2.2倍(P<0.01);抑制miR-148a表达,MDA-MB231细胞葡萄糖摄取量上升1.6倍(P<0.01),乳酸生成量上升1.7倍(P<0...
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第1章 miR-148a通过靶向调节基因HK2对乳腺癌细胞糖酵解代谢的影响
1.1 材料与方法
1.1.1 细胞系
1.1.2 实验主要试剂
1.1.3 实验主要仪器
1.1.4 细胞的复苏
1.1.5 细胞的培养
1.1.6 细胞的传代
1.1.7 细胞的转染
1.1.8 细胞中总RNA的提取
1.1.9 cDNA的制备
1.1.10 HK2过表达载体构建
1.1.11 实时荧光定量PCR
1.1.12 细胞培养液上清液中葡萄糖摄取量的检测
1.1.13 细胞培养液上清液中乳酸水平的检测
1.1.14 蛋白样品的提取
1.1.15 蛋白浓度的测定
1.1.16 免疫印迹试验（Western Blot）检测HK2蛋白的表达水平
1.1.17 BrdU法检测细胞的增殖
1.1.18 双荧光素酶报告实验
1.1.19 统计学分析
1.2 结果
1.2.1 miR-148a在乳腺癌细胞系中的表达情况
1.2.2 过表达miR-148a对MDA-MB231细胞的影响
1.2.3 抑制miR-148a对MDA-MB231细胞的影响
1.2.4 验证miR-148a与HK2基因的靶向关系
1.2.5 miR-148a可逆转HK2过表达所致促葡萄糖摄取效应
1.2.6 miR-148a可逆转HK2过表达所致促乳酸生成效应
1.2.7 miR-148a可逆转HK2过表达所致促细胞增殖效应
1.3 讨论
1.3.1 miR-148a在乳腺癌细胞系中的表达情况
1.3.2 miR-148a对MDA-MB231细胞糖代谢和细胞增殖的影响
1.3.3 miR-148a与HK2基因存在靶向关系
1.3.4 miR-148a靶向抑制HK2逆转由HK2过表达所致促糖酵解和细胞增殖效应
1.4 小结
第2章 HK2基因缺陷型乳腺癌细胞MCF-7中糖酵解代谢的变化
2.1 材料与方法
2.1.1 细胞系
2.1.2 实验主要试剂
2.1.3 实验主要仪器
2.1.4 细胞的复苏及传代
2.1.5 HK2双基因敲除载体的构建
2.1.6 HK2基因敲除载体转染细胞
2.1.7 HK2基因缺陷细胞筛选与测序分析
2.1.8 HK2基因缺陷型MCF-7细胞葡萄糖摄取量检测
2.1.9 细胞培养液上清液中乳酸水平的检测
2.1.10 BrdU法检测细胞的增殖
2.1.11 统计学分析
2.2 结果
2.2.1 敲除质粒转染情况鉴定
2.2.2 基因敲除细胞株的鉴定
2.2.3 HK2基因缺陷对MCF-7细胞葡萄糖摄取的影响
2.2.4 HK2基因缺陷对MCF-7细胞乳酸生成的影响
2.2.5 HK2基因缺陷对MCF-7细胞增殖变化
2.3 讨论
2.3.1 HK2基因敲除载体的构建
2.3.2 HK2基因敲除细胞的获得与鉴定
2.3.3 HK2基因缺陷对MCF-7细胞糖酵解和细胞增殖能力的影响
2.4 小结
参考文献
结论
第3章 综述 miRNA在肿瘤糖酵解过程中的相关研究
3.1 糖酵解途径的相关激酶研究
3.1.1 己糖激酶与肿瘤的相互作用
3.1.2 磷酸果糖激酶与肿瘤的相互作用
3.1.3 缺氧诱导因子与肿瘤的相互作用
3.1.4 丙酮酸激酶与肿瘤的相互作用
3.1.5 乳酸脱氢酶与肿瘤的相互作用
3.2 miRNA在肿瘤细胞糖酵解途径的功能
3.2.1 miRNA调控癌基因/抑癌基因参与糖代谢
3.2.2 miRNA对葡萄糖摄取量的影响
3.2.3 miRNA对乳酸生成量的影响
3.2.4 miRNA对三羧酸循环的影响
参考文献
致谢
在学期间研究成果
本文编号：3886885
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第1章 miR-148a通过靶向调节基因HK2对乳腺癌细胞糖酵解代谢的影响
1.1 材料与方法
1.1.1 细胞系
1.1.2 实验主要试剂
1.1.3 实验主要仪器
1.1.4 细胞的复苏
1.1.5 细胞的培养
1.1.6 细胞的传代
1.1.7 细胞的转染
1.1.8 细胞中总RNA的提取
1.1.9 cDNA的制备
1.1.10 HK2过表达载体构建
1.1.11 实时荧光定量PCR
1.1.12 细胞培养液上清液中葡萄糖摄取量的检测
1.1.13 细胞培养液上清液中乳酸水平的检测
1.1.14 蛋白样品的提取
1.1.15 蛋白浓度的测定
1.1.16 免疫印迹试验（Western Blot）检测HK2蛋白的表达水平
1.1.17 BrdU法检测细胞的增殖
1.1.18 双荧光素酶报告实验
1.1.19 统计学分析
1.2 结果
1.2.1 miR-148a在乳腺癌细胞系中的表达情况
1.2.2 过表达miR-148a对MDA-MB231细胞的影响
1.2.3 抑制miR-148a对MDA-MB231细胞的影响
1.2.4 验证miR-148a与HK2基因的靶向关系
1.2.5 miR-148a可逆转HK2过表达所致促葡萄糖摄取效应
1.2.6 miR-148a可逆转HK2过表达所致促乳酸生成效应
1.2.7 miR-148a可逆转HK2过表达所致促细胞增殖效应
1.3 讨论
1.3.1 miR-148a在乳腺癌细胞系中的表达情况
1.3.2 miR-148a对MDA-MB231细胞糖代谢和细胞增殖的影响
1.3.3 miR-148a与HK2基因存在靶向关系
1.3.4 miR-148a靶向抑制HK2逆转由HK2过表达所致促糖酵解和细胞增殖效应
1.4 小结
第2章 HK2基因缺陷型乳腺癌细胞MCF-7中糖酵解代谢的变化
2.1 材料与方法
2.1.1 细胞系
2.1.2 实验主要试剂
2.1.3 实验主要仪器
2.1.4 细胞的复苏及传代
2.1.5 HK2双基因敲除载体的构建
2.1.6 HK2基因敲除载体转染细胞
2.1.7 HK2基因缺陷细胞筛选与测序分析
2.1.8 HK2基因缺陷型MCF-7细胞葡萄糖摄取量检测
2.1.9 细胞培养液上清液中乳酸水平的检测
2.1.10 BrdU法检测细胞的增殖
2.1.11 统计学分析
2.2 结果
2.2.1 敲除质粒转染情况鉴定
2.2.2 基因敲除细胞株的鉴定
2.2.3 HK2基因缺陷对MCF-7细胞葡萄糖摄取的影响
2.2.4 HK2基因缺陷对MCF-7细胞乳酸生成的影响
2.2.5 HK2基因缺陷对MCF-7细胞增殖变化
2.3 讨论
2.3.1 HK2基因敲除载体的构建
2.3.2 HK2基因敲除细胞的获得与鉴定
2.3.3 HK2基因缺陷对MCF-7细胞糖酵解和细胞增殖能力的影响
2.4 小结
参考文献
结论
第3章 综述 miRNA在肿瘤糖酵解过程中的相关研究
3.1 糖酵解途径的相关激酶研究
3.1.1 己糖激酶与肿瘤的相互作用
3.1.2 磷酸果糖激酶与肿瘤的相互作用
3.1.3 缺氧诱导因子与肿瘤的相互作用
3.1.4 丙酮酸激酶与肿瘤的相互作用
3.1.5 乳酸脱氢酶与肿瘤的相互作用
3.2 miRNA在肿瘤细胞糖酵解途径的功能
3.2.1 miRNA调控癌基因/抑癌基因参与糖代谢
3.2.2 miRNA对葡萄糖摄取量的影响
3.2.3 miRNA对乳酸生成量的影响
3.2.4 miRNA对三羧酸循环的影响
参考文献
致谢
在学期间研究成果
本文编号：3886885
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3886885.html