褐飞虱间α胰蛋白酶抑制剂重链4的功能研究与卵巢上皮栓转录组分析

发布时间：2020-05-20 00:21

【摘要】：褐飞虱Nilaparvata lugens St?l属半翅目同翅亚目飞虱科,是我国乃至亚洲最为严重的水稻害虫。褐飞虱通过刺吸为害水稻,并可传播病害如水稻锯齿叶矮缩病(Rice Ragged Stunt Virus,RRSV)等。不仅如此,褐飞虱的排泄物中含有多种氨基酸和蜜露,常常会引发霉菌滋生,使得水稻大幅度减产。到目前为止,我国防治褐飞虱的常规手段是农药防治,但这带来了褐飞虱的抗药性和环境污染等问题。作为半翅目刺吸性昆虫,褐飞虱食性单一,仅取食水稻韧皮部汁液为生,营养缺乏,但其体内存在类酵母共生菌(Yeast-like Symbionts,YLS),可以为其提供必需氨基酸、胆固醇,并且可以加速氮循环,参与卵黄原沉淀等。在褐飞虱雌成虫羽化后2天起,脂肪体中的YLS释放到血淋巴中,并经由卵巢小管的上皮栓(epithelial plug,EP)入侵卵巢,从而进入卵母细胞,完成经卵传播,说明上皮栓在YLS经卵垂直传播中起着关键作用。课题组前期研究发现,间α胰蛋白酶基因(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4)在褐飞虱原羽化后第2天,表达量显著上升,说明其可能与褐飞虱生殖相关,也可能与YLS入侵卵巢有关。本文对褐飞虱ITIH4的功能进行了研究,并对卵巢上皮栓的特异基因表达进行了分析,研究结果如下:(1)克隆得到褐飞虱ITIH4基因,其开放阅读框全长2724bp,翻译907个氨基酸,等电点6.17,经Signal P预测信号肽位点在第24位氨基酸处。通过序列比对和建立系统进化树发现,ITIH4在半翅目中保守。通过NCBI检测到褐飞虱ITIH4转录出的蛋白质序列有两个结构域保守,分别是穹窿蛋白间α胰蛋白酶结构域(Vault protein inter-alpha-trypsin domain,VIT)和冯维勒布兰德因子A型(Von Willebrand factor type A,v WFA)结构域。荧光定量实验发现,褐飞虱ITIH4在若虫2龄期之间表达量最高,4龄最低,在羽化后第二天的雌成虫中显著上调。ITIH4基因表达RNA干扰后,褐飞虱死亡率非常高,在羽化的第4天死亡率累积超过87%。实验组注射后10天平均产卵量为29.4枚,比对照组降低了57.3%,实验组卵孵化率为63.5%,低于对照组(87.7%)。被RNA干扰的褐飞虱卵巢发育较未被干扰的缓慢,卵黄蛋白前体——卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)以及卵黄蛋白原受体(Vitellogenin Receptor,Vg R)的表达均下调,说明ITIH4可能协调上述基因而影响褐飞虱生殖。结合产卵量与孵化率统计,推测ITIH4的干扰会阻止Vg的形成和累积,从而影响褐飞虱卵的发育,甚至致死;昆虫卵黄沉淀受保幼激素(juvenile hormone,JH)调控,保幼激素受体(Methoprene-tolerant,Met)在褐飞虱体内介导保幼激素的行为。经荧光定量PCR检测保幼激素受体表达量,除注射第3天的试虫外,并没有发现显著差异。KEGG通路分析显示,调控Vg及卵巢发育的基因如胰岛素生长因子IGF、转化生长因子TGFB等与ITIH4在大分子的胞吞作用中可能存在共表达。综上所述,ITIH4在褐飞虱生殖过程中对卵巢的发育和卵黄蛋白原的合成、累积起重要作用。(2)解剖获得褐飞虱卵巢的卵巢小管柄(petiole)、上皮栓、卵泡(follicle)等3个组织的滤泡细胞,进行Illumina转录组高通量测序,对上皮栓的特异表达基因进行筛选和分析。本研究应用高通量测序,获得78427277条序列,平均长度517bp,经Trinity法拼接组装后将这些基因与公共数据库(KEGG,KOG,Pfam,NR和SWISS-Prot)对比后,注释了151422条基因。通过分析注释数据,发现上皮栓处有关内膜(endosome membrane)、胞吞作用(endocytosis)、细胞质膜结合囊泡(cytoplasmic membrane-bounded vesicle)的基因表达显著高于卵泡和卵巢小管柄,推测这些基因可能是有关YLS侵入卵巢部位有关。其中DNAJC1、TGFBR1等蛋白与ITIH4可能存在互作。
【图文】：

结构图,卵巢,小管,结构图

图 1.1 卵巢小管结构图[17]G：gonad 生殖腺，V：vitellariuYLS: yeast-like symbionts 类酵母发育情况，可将褐飞虱卵巢V 级，参表 1.1。1.1 褐飞虱卵巢发育情况分级卵巢主要形态相粘粘，小管的生殖区和小管本部渐延伸，，卵黄腺的长度明显比生殖侧输卵管中央缢缩，连接到卵巢小续长大，卵巢小管柄(ovariole ped

褐飞虱,拷贝数

图 2.1 褐飞虱 RNA 电泳泳道 M 为 DL2000 DNA Marker，泳道 1-5 为 1-5 龄若虫 RNA，泳道 6-10 为 1-5雌成虫 RNA，泳道 11-15 为 1-5 日龄短翅雌成虫 RNA。.2 褐飞虱 ITIH4基因的扩增在 pMD-19T 载体上的克隆位点是 BcaBEST Sequencing Primer M13-4-M 结合位点。基因片段拷贝数相关的公式为：拷贝数(copies/mL)=6.02×1023×浓度(g/ML)÷[目的片段大小(b0(dalton/bp)]在本实验中，预测的目的片段大小约为 3000bp，测得浓度 54.3ng/μL 式，得到拷贝数 1.65×1014拷贝每毫升。转入感受态大肠杆菌后扩繁，板涂布，挑取单克隆，菌液 PCR 后进行电泳，条带大小符合预期（如图 2克隆菌株送交上海桑尼生物科技有限公司对目的片段进行测序。
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.112.3

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