PnATXs转基因小黑杨生理生化指标测定及启动子缺失分析

发布时间：2020-04-02 21:57

【摘要】：铜离子在生物体内具有重要作用,缺铜会影响生物体生长发育,但是过量的铜离子也具有潜在毒性,生物体在进化过程中形成了复杂的调控机制确保细胞内铜离子稳态。此外,进入细胞的铜离子会被蛋白质和小分子配体螯合,这些铜离子的转运是通过铜伴侣蛋白完成的。本研究利用已经克隆的小黑杨铜伴侣蛋白基因PnATX1和PnATX2,通过Gateway方法构建RNAi表达载体,遗传转化小黑杨后获得了转基因株系。PCR方法获得小黑杨PnATXs启动子的缺失序列后,构建了缺失序列与GUS基因的融合表达载体并遗传转化拟南芥;GUS染色初步确定了PnATX1和PnATX2启动子缺失序列的生物学活性。以PnATXs过表达小黑杨株系为试材,测定了转基因植株和野生型植株在铜胁迫处理条件下的生理生化指标。主要研究结果如下:(1)利用Gateway方法,通过BP反应和LR反应成功构建了小黑杨PnATXs基因的RNAi表达载体,电转化农杆菌感受态细胞后获得了含有重组质粒的农杆菌菌株。通过叶盘法遗传转化小黑杨后获得了 10个PnATX1-RNAi和6个PnATX2-RNAi抗性株系。PCR及qRT-PCR鉴定结果显示,获得的小黑杨PnATX1和PnATX2的RNAi株系中PnATX1、PnATX2基因的表达量受抑制程度存在差异。与野生型植株相比,PnATX1-RNAi转基因株系中,3、5、9号地上部PnATX1基因的表达量显著降低,10号转基因株系根和地上部PnATX1基因的表达量均显著下降;PnATX2-RNAi株系中,2、3、4、5、6号的地上部PnATX2基因的表达量显著降低。(2)利用PnATX全长启动子序列设计引物,并通过PCR方法分别获得了PnATX1和PnATX2启动子的3段缺失序列(PnATX1-1、PnATX1-2、PnATX1-3和PnATX2-1、PnATX2-2、PnATX-3)。利用启动子缺失片段替换植物表达载体pBI121的35S启动子后与GUS基因构建融合表达载体,通过农杆菌介导的蘸花法遗传转化拟南芥野生型植株。T2代转化植株的GUS染色结果表明,PnATX1-3和PnATX2-3启动子缺失序列具有启动功能,而PnATX1-1、PnATX1-2、PnATX2-1和PnATX2-2启动子缺失序列不能启动报告基因GUS表达。利用缺铜和含有不同铜离子浓度(5 μmoL/L和50μmoL/L)的培养基培养拟南芥T2代转化株系,组织化学染色结果表明,PnATX1-3和PnATX2-3启动子缺失序列转化的拟南芥中GUS基因的表达不受铜离子浓度影响。小黑杨PnATX1和PnATX2启动子不同缺失片段应答铜离子胁迫的具体机制尚需进一步试验验证。(3)在缺铜、正常铜离子浓度和高浓度铜离子条件下处理小黑杨野生型植株、小黑杨PnATX1过表达株系2、3、5号及PnATX2过表达株系1、2、5号,并测定处理植株的根长、株高、叶面积、叶绿素含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)酶活及丙二醛(MDA)含量。缺铜、正常铜浓度和高浓度铜离子处理后,小黑杨野生型植株和PnATX过表达植株的株高和叶面积无明显差异。与野生型植株相比,缺铜和正常铜浓度处理后PnATXs乃过表达植株的根长无显著变化,10μmol/L Cu2+处理后,PnATX1过表达3号和5号株系根长显著增加;15μmol/L Cu2+处理后PnATX1过表达3号、5号株系和PnAX2过表达5号株系的根长显著增加;高浓度铜离子处理后小黑杨PnATX1和PnATX2过表达植株的叶绿素含量显著高于野生型植株。丙二醛含量测定结果表明,与野生型植株相比,3号PnATX1过表达株系和1号PnATX2过表达株系应答缺铜处理幼叶的丙二醛含量显著降低,而其他转基因株系幼叶和成熟叶片丙二醛含量在正常铜浓度和缺铜处理后无明显变化。高浓度铜离子处理后,尤其是15 μmol/L铜离子处理后,小黑杨PnATX1和PnATX2过表达植株的幼叶和成熟叶片SOD活性显著高于野生型植株。此外,10 μmol/L和15 μmol/L CuSO4处理后,PnATX1过表达2号转基因株系成熟叶片POD活性、PnATX1过表达5号转基因株系和PnATX2过表达5号转基因株系幼叶CAT活性与野生型植株无显著差异,其余各转基因小黑杨植株幼叶和成熟叶片的过氧化物酶及过氧化氢酶活性均显著高于野生型植株。这些工作为更深入地阐明小黑杨铜伴侣蛋白PnATX1和PnATX2的生物学功能及其在维持杨树细胞铜稳态过程中发挥的具体功能奠定了试验基础。
【图文】：

２．３．１小黑杨尸／＾ｍ基因ＲＮＡｉ表达载体的构建逡逑用尸Ｗ７Ｘｓ－ＲＮＡｉ－Ｆｌ和ＰＷ７＾－ＲＮＡｉ－Ｒｌ引物进行质粒ＰＣＲ，扩增和逡逑基因的用于构建ＲＮＡｉ载体的目的条带。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图２－１所逡逑示，成功扩增了长度为１４５邋ｂｐ和１４１邋ｂｐ的Ｊ７Ｘ／－ＲＮＡｉ及ｄ７Ｘ２－ＲＮＡｉ目的条带。逡逑Ｍ逦１逦２逡逑ｔ悘媝：逡逑图２－１邋Ｐ／ＭＴ＾－ＲＮＡｉ目的条带的ＰＣＲ扩增结果逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｐｄｒａ－ＲｌＮＡｉ邋目的条带；２：邋ＰＨｊｒａ－ＲＮＡｉ邋目的条带。逡逑利用高保真ＤＮＡ聚合酶ＫＯＤ和ａｔｔＢ引物，采用两步ＰＣＲ法在Ｐ以７Ｘｙ－ＲＮＡｉ目逡逑的条带的两端引入加成位点。第一次ＰＣＲ完成后纯化扩增产物进行第二次ＰＣＲ扩增。逡逑纯化ＰＣＲ扩增产物。扩增条带纯化产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示（图２－２Ａ，逡逑Ｂ），加入了如重组位点的Ｐｉ＾ｒＡ－ＲＮＡｉ目的条带的ＰＣＲ扩增产物纯化成功，可以用逡逑于ＢＰ反应。逡逑－１４邋－逡逑

Ａ：邋Ｐ／；／ｉｍ－ＲＮＡｉ目的条带连接部分位点的ＰＣＲ纯化产物；Ｂ：含有完整《？５位点的逡逑／ＷＪ７Ｘｖ－ＲＮＡｉ目的条带的ＰＣＲ纯化产物。逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｐ／Ｉ／４７Ｘ７－ＲＮＡＩ邋条带；２：邋／＞／ｔ４７Ｘ２－ＲＮＡｉ邋条带。逡逑利用含有ａｔｔＢ位点的／＾７Ｘｓ－ＲＮＡｉ目的条带与ｐＤＯＮＲ？载体进行ＢＰ反应，获得逡逑ｅｎｔｒｙ载体。将ｅｎｔｒｙ载体转化ＴｒａｎｓＴｌ－１感受态细胞，，在含有卡那霉素的平板上筛选阳逡逑性克隆。将阳性克隆扩大培养后提取质粒，用也引物对质粒进行ＰＣＲ扩增检测。扩逡逑增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图２－３所示，Ｐ＾ｒ＾－ＲＮＡｉ目的条带的ｅｎｔｒｙ载体逡逑均可扩增出预期大小的目的片段，由此表明，Ｐ＾７＾－ＲＮＡｉ目的条带的ｅｎｔｒｙ载体构建逡逑成功，可以进行ＬＲ反应。逡逑Ｍ１邋２３４５６７８逡逑ＺｉＭｉＯｂｐ逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.11

【参考文献】

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1 Vincent L.Chiang;;Conservation and Diversity of MicroRNA-associated Copper-regulatory Networks in Populus trichocarpa[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年11期

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1 徐进;马铃薯StSUT2基因干扰载体的构建及遗传转化[D];兰州理工大学;2017年

本文编号：2612492