油松雌配子体游离核有丝分裂期胚珠差异蛋白质组学研究

发布时间：2020-10-15 04:56

　　 雌配子体(megagametophyte)是胚珠的核心结构,雌配子体游离核分裂期是胚珠发育过程中的关键时期。核分裂的失败将阻碍雌配子体的成熟和卵细胞的产生,可导致植株雌性不育。所以,对该时期胚珠发育的分子调控机制进行研究,具有重要的理论和实践意义。目前,调控胚珠发育的分子机制已见报道,但主要围绕被子植物展开,对裸子植物的相关研究较少。而裸子植物的胚珠发育与被子植物不同,特别是木本植物,其差异更加明显。课题组在前期研究中发现辽宁省兴城油松(Pinus tabulaeformis Carr.)种子园内的油松28号雌性不育系胚珠败育,主要原因是雌配子体游离核中途停止分裂,并认为这一雌性不育现象是多种基因共同调控表达的结果。蛋白质是功能基因综合表达的产物,更能直接体现植物生长发育的调控特点。因此,本论文采用双向电泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)及相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)等蛋白质组学技术,辅以形态学、解剖学和分子生物学等研究手段,对油松可育系(fertile line,FL)和不育系(sterile line,SL)雌配子体游离核有丝分裂期的胚珠差异表达蛋白质组进行研究,以揭示28号不育系雌配子体游离核有丝分裂中途停止的分子调控机制。主要研究结果如下:1.对油松大孢子叶球发生发育过程中的形态学和解剖学特征进行了系统观察,准确掌握了胚珠发育的阶段,得到主要结果如下:在第1年秋季,当油松新芽纵径(longitudinal diameter,LD)约为7.0 mm时,腋芽原基发育,入冬后花芽休眠。至第2年春季初生大孢子叶球LD(ovulate strobilus LD,LDOs)约为5.0 mm时,胚珠细胞分化。在LDOs约为6.0 mm时,大孢子母细胞分化;约为11.0 mm时,胚珠中存在数十个游离核;之后,胚珠越冬休眠。到第3年春季,LDOs约为21.0mm,游离核数目达几千个;当雌配子体开始形成细胞壁时,LDOs约为31.0 mm。在LDOs约为37.0 mm时,颈卵器原始细胞分化;约为43.0 mm时,颈卵器、卵细胞发育成熟,雌配子体细胞化完成;约为45.0 mm时,受精作用发生。至秋季LDOs约为53.0 mm时,球果内即可观察到成熟胚。油松大孢子叶球的发生发育过程共历时26个月,跨越3年。2.对处于雌配子体游离核旺盛分裂期的油松两系胚珠蛋白质组进行了基于2-DE技术的分离分析。最终在FL和SL胚珠中分别分离到蛋白质1424个和1224个。有42个蛋白质在两系胚珠中差异表达(ratio1.5)。其中,SL胚珠与FL相比有9个蛋白质表达量下降,33个上升。质谱分析成功鉴定了 9个蛋白,它们是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、钙调素、ATP合酶β亚基、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、依赖于DNA的RNA聚合酶B、泛酸激酶、热激同源蛋白70-1以及两个未知蛋白。它们与物质和能量代谢、细胞周期、转录调控及胁迫抵抗相关,暗示SL油松胚珠中物质和能量代谢异常、可能遭受胁迫。3.对处于雌配子体游离核分裂前、后期的油松两系胚珠蛋白质组进行了基于iTRAQ技术的分离分析。最终鉴定到蛋白质4192个,四组有效比对中各包含差异表达蛋白质400多个(ratio1.2)。质谱定性和生物信息学分析结果表明,有至少37个差异蛋白参与油松胚珠发育的调控,包括肉桂酰辅酶A还原酶、过氧化物酶前体、电子传递黄素蛋白:泛醌氧化还原酶、谷胱甘肽转硫酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位、类钙调磷酸酶B亚基、DNA复制蛋白A、甘油-3-磷酸酰基转移酶6等。它们在油松两系胚珠中的差异表达情况表明:在SL油松雌配子体游离核有丝分裂期,(1)胚珠内的物质供给短缺和能量代谢异常共同导致了蛋白质合成和DNA复制发生异常。(2)在肝珠遭受氧化胁迫时,与细胞信号转导相关的蛋白质不能抑制乙烯的生成,也不能削弱H202造成的胁迫伤害。所以,不断积累的H202和过高含量的乙烯,破坏了质膜的半透性,影响了 Ca2+的浓度和蛋白质的磷酸化,损伤了生物大分子的结构和功能,导致了 DNA双链断裂(Double-Strand Breaks,DSBs)的发生。(3)当DNA复制异常及损伤时,肝珠中细胞周期阻滞、DNA损伤修复失败。所以,SL肝珠细胞最终开启了细胞程序化死亡进程,导致雌配子体游离核有丝分裂失败。4.通过荧光反转录实时定量PCR技术,研究了 DNA依赖蛋白激酶催化亚单位、谷胱甘肽转硫酶、DNA复制蛋白A等10个差异蛋白在油松雌配子体游离核有丝分裂期胚珠mRNA的表达规律,验证了蛋白质组学的研究结果。
【学位单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S791.254
【部分图文】：

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?（４）从第２年５月中旬开始，球果缓慢长大，珠鱗的颜色由红转绿后变为棕色??（图２－４?Ａ？Ｊ）。此后，球果生长缓慢，冬季休眠（图２－５?Ａ？Ｊ）。??卜—ｊ??＿藝酵??们｜丨驛；ｍ??■ｆｔ?｜０＞５ｍｌｍ?５．〇ｍｍ?■?０．?Ｓｆｒｉｉｍ?５〇ｍ—?ｐ?５ｍｉｍ?５０?ｍｍ??Ｊ??４０＊０?「??————一——————￣———一．．．．．．??３５．０?－?????????—－?????ｊ?２５．０????２０．０?＾?－?――—．．．???－．一——－…．…．．?．????＿?１５．０?．．－．．．？．．———————ａ——？．…ａ?ａ?ａ?ａ?ａ．……．??Ｉ?三?ｆｅｍｊｊｊｊｊ??５－１０?５－２０?５－３０?６－１０?６－２０?６－３０?７－１０?７－２０?７－３０??曰期??图２－４油松球果??Ｆｉｇ．２－４?Ｃｏｎｅｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ??注：图板所示为第２年５月１０日（Ａ）、５月２０日（Ｂ）、５月３０日（Ｃ）、６月１０日（Ｄ）、６月??２０日（Ｅ）、６月３０日（Ｆ）、７月１０日（Ｇ）、７月２０日（Ｈ）和７月３０日⑴的油松球果。图??Ｊ为球果纵径柱状图，数值由３次生物学重复获得，表示为平均值：ｔＳＥ，小写字母表示多重比较??分析结果（Ｐ?＜?０．０５）。（Ｔｈｅ?ｐｌａｔｅ?ｓｈｏｗｅｄ?ｔｈｅ?ｃｏｎｅｓ?ｏｆ?Ｐ．?／Ｍｗ／ａ吻，７？治?ｉｎ?Ｍａｙ?１０?（Ａ），?Ｍａｙ?２０?（Ｂ），Ｍａｙ??３０?（Ｃ）

本文编号：2841726