马尾松磷转运相关转录因子PmWRKY164的克隆及功能分析

发布时间：2020-10-16 12:12

　　 磷是植物生长发育所必需的营养元素,热带和亚热带地区土壤中有效磷的缺乏是制约农林业生产产量提高的重要限制性因子。发掘与利用植物耐低磷相关基因,创制磷高效利用新种质是解决上述问题的有效途径。马尾松作为我国重要的本土树种,在农林经济上有着重要的价值,然而南方土壤有效磷缺乏严重影响马尾松的经济产量,因此挖掘低磷胁迫响应的关键基因具有重要的意义,为马尾松的抗低磷分子育种和种质创新提供理论依据。在前期工作基础中,基于马尾松低磷胁迫RNA-Seq数据,筛选到了4个差异表达马尾松WRKY转录本序列。本文以马尾松耐低磷种质为材料,获得了显著差异表达的WRKY转录因子Unigene,并对其在重度低磷胁迫下时空差异表达进行分析;利用荧光定量PCR对低磷胁迫响应WRKY转录因子进行筛选,采用RACE方法克隆了应答低磷胁迫的WRKY转录因子(PmWRKY164)全长序列,构建了表达载体并进行遗传转化。主要研究结果如下:1.通过RT-PCR与荧光定量PCR相结合,检测了4个WRKY转录因子Unigenes在低磷胁迫中表达情况。结果表明,在重度低磷P_1(营养液磷含量0.5mg/L)胁迫下,WRKY164在整个低磷胁迫中持续上调表达。2.利用RACE技术,克隆出WRKY164全长序列,命名为PmWRKY164。序列分析表明,PmWRKY164全长共1,977 bp;完整开放阅读框(ORF)为1,164 bp,5’-UTR大小为65 bp,3’-UTR大小为748 bp,共编码387个氨基酸。3.生物信息学分析表明,PmWRKY164蛋白序列中存在WRKY家族结构区域,为WRKY家族里第Ⅱb类WRKY成员;同源性分析表明,PmWRKY164在WRKY家族保守区域上与其他植物相似性较高。系统进化树分析表明,PmWRKY164与红豆杉和银杏亲缘关系最接近。4.组织特异性表达分析发现,PmWRKY164为组成型表达,在根、茎、叶中均有表达,叶中表达量最高,根中次之,茎中最低。在根和茎中,36 d的表达量最低,60 d的表达量最高;而在叶中,12 d的表达量最低,60 d的表达量最高;除了叶中的表达量呈现上升的趋势以外,根、茎表达量均呈现上升-下降-上升的趋势。5.构建了PmWRKY164基因超表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法将PmWRKY164基因转化模式植物烟草。经过筛选与PCR分子检测,成功鉴定了20个能正常表达外源基因转基因烟草株系;经qRT-PCR检测,从转基因烟草中筛选出3个表达量较高的转基因株系(Line-2、Line-3、Line-8)进行后续试验。6.对转基因与野生型烟草进行不同浓度磷胁迫处理,检测其生理生化反应。结果表明低磷胁迫下,除了MDA含量低于野生型之外,磷含量、Apase活性、POD活性及SOD活性在转基因烟草中均显著高于野生型;而正常磷及高磷条件下,转基因与野生型植株并无明显差异。因此,推测超表达PmWRKY164基因显著提高了植株的耐低磷能力。7.超表达PmWRKY164基因对烟草磷转运蛋白PHO1的表达分析显示,在低磷条件下转基因植株冠部PHO1含量显著高于野生型;在正常供磷条件下,该基因表达量在野生型与转基因植株中无显著差别,这意味着PmWRKY164对烟草PHO1作用明显,可能通过正调控而促进PHO1的表达,从而促进植株对磷的吸收,提高植株耐低磷胁迫的能力。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S791.248
【部分图文】：

图 1-1 Ⅰ（Ⅰ-N 端和Ⅰ-C 端）、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe 和Ⅲ五类 WRKY 转WRKY 结构域注：阴影部分代表 WRKY 结构域中内含子的位置Fig. 1-1 Ⅰ（Ⅰ-N andⅠ-C）、Ⅱa+Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd+Ⅱe and Ⅲ, Five kinds otranscription factor WRKY domain.Note: The shadow part represents the intron position in the WRKY dom

低磷胁迫马尾松材料

图 2-2 低磷胁迫对马尾松含量的影响A: 总磷含量 B: 无机磷含量注：R：根 L+S：叶和茎Figure 2-2 Effect of low phosphorus stress on phosphorus content in Pinus massonianaA: Total phosphorus content; B: Inorganic phosphorus contentNote: R: Root L+S: Leaf and Stem
【参考文献】

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本文编号：2843239