巴西橡胶树抗白粉病相关基因HbGNOM和HbFER的克隆及初步功能分析

发布时间：2020-11-04 03:04

　　 天然橡胶是重要的战略物资和工业原料,在国民经济中占据重要地位。白粉病是橡胶树的重要叶部病害,严重影响天然橡胶的产量和质量。在前期研究中,我们利用RNA-Seq技术对橡胶树叶片受白粉病菌侵染前后的基因差异表达情况进行了分析,发现编号为CL13480和CL406的cDNA序列在白粉病菌侵染前后的橡胶树叶片中的表达水平发生了明显变化,分别将其命名为HbGNOM和HbFER。在此基础上,本研究对这两个基因进行了全长克隆和相关的功能分析,具体结果如下:1.HbGNOM基因的cDNA编码区全长为4410bp,编码一个含1470氨基酸的蛋白。生物信息学表明橡胶树HbGNOM基因的编码蛋白含有Sec7保守结构域,与麻风树(Jatrophacurcas)、木薯(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的GNOM蛋白高度相似,其相似性分别为97%、96%、95%和84%。半定量分析结果表明HbGNOM基因在叶片中的表达受植物激素乙烯(ET)的诱导,但对水杨(SA)、茉莉酸(JA)、赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)的处理没有明显应答。当橡胶树受到白粉病菌侵染时,HbGNOM基因在叶片中的表达明显升高,但对炭疽病菌的侵染不产生应答。以上结果暗示HbGNOM参与橡胶树对白粉病的抗病反应,可能与乙烯信号传导途径有关。亚细胞定位的结果表明,HbGNOM蛋白定位在细胞膜和内质网上。2.在前期研究中,实验室已经克隆了橡胶树HbFER基因的全长,生物信息学分析表明HbFER基因全长2679 bp,编码一个长892个氨基酸的多肽,包含Malectin_like和PTKc两个保守结构域,半定量表达分析结果表明PAMPs分子鞭毛蛋白(flg22)和几丁质(Chitin)能够抑制HbFER基因的表达。在此基础上我们进一步研究了HbFER基因的表达模式。橡胶树接种白粉病菌能够明显诱导HbFER基因的上调表达,而接种炭疽病菌的橡胶树叶片中HbFER基因的表达没有明显变化;水杨酸(SA)和赤霉素(GA)处理橡胶树叶片能够诱导HbFER基因的表达,但茉莉酸(JA)、乙烯(ET)、脱落酸(ABA)处理对HbFER基因的表达没有明显的影响。亚细胞定位结果显示,HbFER蛋白定位在细胞膜上。以上结果表明,HbFER基因参与橡胶树对白粉病的抗性,与SA和GA介导的信号转导途径有关,与JA、ET、ABA信号途径关系不大。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S763.7
【部分图文】：

?基因片段全长的克隆??利用引物ＨｂＧＮＯＭ－Ｆ、ＨｂＧＮＯＭ－Ｒ，通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法对册ＧｉＶＯＭ基因的??全长进行扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图２。从图中可以看到，在大??约４５００ｂｐ处有单一条带，与预期基因片段条带大小一致。序列测定结果表明该片段??长度为４４１０ｂｐ，是一个完整性的开放性阅读框，编码一个１４７０个氨基酸的多肽（图??３）。?Ｍ?１??Ｉ??圓??图２册ＧＭＷ／基因的ｃＤＮＡ全长扩增（Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ５０００；?１：?／ＷＧＴＶＯＭ基因ｃＤＮＡ片段）??Ｆｉｇ．?２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｕｌｌ?ｌｅｎｇｔｈ?ＨｂＧＮＯＭ?ｃＤＮＡ?ｂｙ?ＲＴ－ＰＣＲ??（Ｍ：?Ｌａｄｄｅｒ?５０００；?１：?ｃＤＮＡ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?ｏｆ?ＨｂＧＮＯＭ）??１６??

本实验采用ＣＴＡＢ－ＬｉＣｌ大提法提取橡胶树叶片的ＲＮＡ，并将提取的ＲＮＡ溶于??ＤＥＰＣ处理过的无离子水中，取适量的ＲＮＡ样品进行甲醛变性凝胶电泳检测，结果??见图１。从图中可以清楚看到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ三条特异条带，通过分光光度计检测的??ＯＤ２６〇／ＯＤ２８〇的比值在１．９－２．１范围之内，适合进行反转录反应。??２Ｓｓ－ｐ＊Ｗ＾??丨‘卞－??必，＇??二??图１橡胶树叶片总ＲＮＡ的提取??Ｆｉｇ．?１?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｌｅａｆ?ｏｆ?Ｈｅｖｅａ?ｂｒａｓｉｈｅｎｓｉｓ??２．１．２?基因片段全长的克隆??利用引物ＨｂＧＮＯＭ－Ｆ、ＨｂＧＮＯＭ－Ｒ，通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法对册ＧｉＶＯＭ基因的??全长进行扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图２。从图中可以看到，在大??约４５００ｂｐ处有单一条带，与预期基因片段条带大小一致。序列测定结果表明该片段??长度为４４１０ｂｐ，是一个完整性的开放性阅读框，编码一个１４７０个氨基酸的多肽（图??３）。?Ｍ?１??Ｉ??圓??图２册ＧＭＷ／基因的ｃＤＮＡ全长扩增（Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ５０００；?１：?／ＷＧＴＶＯＭ基因ｃＤＮＡ片段）??Ｆｉｇ．?２?Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｕｌｌ?ｌｅｎｇｔｈ?Ｈ

２．４．１亚细胞定位载体ｐＵＣ１９－３５ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ的构建??构建ＨｂＧＮＯＭ蛋白亚细胞定位的重组载体ｐＵＣ〗９－３５ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ，重组载??体的酶切鉴定结果见图８。图中可以看出，通过＆／Ｉ和５说６?Ｉ双酶消化得到的片段与??预期的片段大小相符，说明ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ融合基因己经重组到表达载体上。测序验??证后用于后续分析。??４〇〇〇ｂ＂Ｌｆ??图８重组载体ｐＵＣ１９－３５ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ的双酶切鉴定??（Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?１００００；?１：心／?Ｉ和仍幼Ｉ的双酶切）??Ｆｉｇ．?８?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＵＣ１９－３５Ｓ－ＨｂＧＮＯＭ－ＧＦＰ?ｂｙ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??２２??
【参考文献】

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本文编号：2869519