小麦RING E3泛素连接酶TaDIS1耐旱作用机制研究

发布时间：2024-06-29 13:15

　　植物为了抵御非生物逆境胁迫造成的伤害,体内会产生各种应对的作用机制,其中,泛素/26S蛋白酶体系统是最重要的机制之一。干旱是最常见的非生物逆境,严重危害小麦的产量。本研究在前期克隆小麦干旱胁迫响应基因TaDIS1及功能初步分析的基础上,通过酵母双杂交技术筛选TaDIS1的互作蛋白及体内、外验证,并对其互作蛋白进行初步功能分析,最后通过体外泛素化实验和降解实验解析其作用机理。取得以下研究结果:1.通过酵母双杂实验筛选出TaDIS1的8个潜在互作蛋白,其中TaSTP是其互作蛋白之一,根据序列比对及结构分析结果表明该蛋白是一种逆境蛋白,可能与ABA调控途径有关。TaSTP基因全长为887bp,包含89bp的5’UTR区、462bp的ORF和336bp的3’UTR区。2.为了排除酵母双杂交实验可能出现的假阳性,我们通过BiFC,Pull-Down,CoIP实验对TaDIS1与TaSTP的互作关系进行验证。在BiFC实验中,发现TaDIS1和TaSTP在烟草叶片细胞的某一内含体发出荧光,表明TaDIS1和TaSTP在细胞内部互作;Pull-Down实验结果表明,TaDIS1在体外可以被TaSTP...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
    1.1 植物响应干旱胁迫的研究现状
        1.1.1 干旱胁迫对植物的影响
        1.1.2 植物响应干旱胁迫的研究进展
    1.2 泛素/26S蛋白酶体途径的研究现状
        1.2.1 泛素化过程
        1.2.2 E3泛素连接酶的种类
    1.3 泛素/26S蛋白酶体途径在逆境胁迫中的研究现状
        1.3.1 泛素/26S蛋白酶体途径在植物应对逆境胁迫中的作用
        1.3.2 E3泛素连接酶的研究现状
    1.4 酵母双杂交筛库系统进展
        1.4.1 酵母双杂交筛库的原理
        1.4.2 酵母双杂交筛库技术的优缺点
        1.4.3 酵母双杂交筛库技术研究现状
    1.5 双分子荧光互补实验进展
        1.5.1 双分子荧光互补实验的原理
        1.5.2 双分子荧光互补实验的优缺点
        1.5.3 双分子荧光互补实验的研究现状
    1.6 GST Pull-Down实验进展
        1.6.1 GST Pull-Down技术的原理
        1.6.2 GST Pull-Down技术的优缺点
        1.6.3 GST Pull-Down技术的研究现状
    1.7 免疫共沉淀实验进展
        1.7.1 免疫共沉淀技术的原理
        1.7.2 免疫共沉淀技术的优缺点
        1.7.3 免疫共沉淀技术的研究现状
    1.8 体外泛素化实验进展
        1.8.1 体外泛素化实验原理
        1.8.2 体外泛素化实验研究现状
    1.9 26S蛋白酶体降解途径实验进展
    1.10 荧光定量实验进展
    1.11 本研究的目的意义及技术路线
        1.11.1 目的意义
        1.11.2 技术路线
第二章 小麦TaDIS1互作蛋白的筛选及鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 质粒和菌株
        2.1.2 主要试剂和配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 诱饵载体pGBKT7 载体的构建
        2.2.2 将文库质粒导入Y187 菌株
        2.2.3 从中国春的c DNA文库筛选互作蛋白
        2.2.4 将筛选出的互作蛋白进行回转验证
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 自激活和毒性验证的结果与分析
        2.3.2 初步筛选出的互作蛋白的结果与分析
        2.3.3 回转验证的结果与分析
    2.4 讨论
第三章 Ta DIS1与TaSTP互作关系的验证
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株,质粒和试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 引物的设计
        3.2.2 载体的构建
        3.2.3 BiFC实验和亚细胞定位实验
        3.2.4 Pull-Down实验
        3.2.5 CoIP实验
    3.3 实验结果与分析
        3.3.1 TaDIS1与TaSTP的定位情况
        3.3.2 TaDIS1与TaSTP的共定位分析
        3.3.3 蛋白的原核表达结果及分析
        3.3.4 体外互作验证的结果与分析
        3.3.5 体内互作验证的结果与分析
    3.4 讨论
第四章 TaDIS1的酶活分析及其底物蛋白的验证
    4.1 实验材料
        4.1.1 质粒和菌株
        4.1.2 主要试剂和配方
    4.2 实验方法
        4.2.1 定点突变的引物设计
        4.2.2 进行定点突变
        4.2.3 载体构建
        4.2.4 进行体外泛素化实验
        4.2.5 进行降解实验
    4.3 实验结果
        4.3.1 TaDIS1 和突变的酶活验证
        4.3.2 底物蛋白的验证与分析
    4.4 讨论
第五章 TaSTP对逆境胁迫下的表达分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 试剂
    5.2 实验方法
        5.2.1 荧光定量引物的设计
        5.2.2 小麦材料的的处理
        5.2.3 小麦RNA的提取
        5.2.4 cDNA的合成
        5.2.5 进行qRT-PCR反应
    5.3 实验结果与分析
        5.3.1 RNA的质量检测
        5.3.2 TaSTP的表达模式分析
    5.4 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3997609