10个凡纳滨对虾家系在两种盐度下的生长状况及3个相关基因的表达研究

发布时间：2020-04-24 00:34

【摘要】：凡纳滨对虾,又名南美白对虾,因其抗逆性强、生长快、繁殖期长、肉味鲜美、耐低盐度且易于集约化养殖等优点,成为世界三大对虾养殖品种之一。由于养殖环境的恶化、亲虾种质退化、加之近年来各种病害的爆发,对我国整个凡纳滨对虾养殖产业造成巨大的冲击。因此,深入开展凡纳滨对虾良种的选育,已成为我国凡纳滨对虾产业可持续发展的当务之急。本文以关岛大学SPF凡纳滨对虾种群中经系统选育的子五代为亲本,运用人工授精方式得到的10个凡纳滨对虾子代家系,比较海水(盐度32)和淡化(盐度2)养殖条件下,不同家系的生长性能及相关基因的表达情况,选育优良生长性能与更适淡化养殖的凡纳滨对虾家系,为凡纳滨对虾的良种选育提供参考,具体研究内容结果如下:1.本试验通过精液移植人工授精方式的初步探索,并以此方法培育出的10个新的凡纳滨对虾家系作为后续的实验材料。该人工授精法是通过将雄虾精荚的豆状体精液直接涂抹到雌虾的纳精囊上的方式,研究不同雌雄亲虾的体重对授精成功率、受精率及孵化率的影响,并通过与其他学者的其它人工授精方式的比对,分析此方法的优劣。结果表明:当雌虾体重≥40g、雄虾≥35g时,该方法具有较高的授精成功率,当雌虾体重小于40g,雄虾小于35g时,其授精成功率和受精率达到最低;受精率方面,雌虾体重为W(40-45g)时达到最高,W(≤40g)时最低,由高到低为:W(40-45g)W(≥50g)W(45-50g)W(≤40g);当雄虾体重为W(40-45g)时,受精率也达到最高,W(≤35g)时受精率最低,由高到低分别为:W(40-45g)W(35-40g)W(≥45g)W(≤35g)。平均孵化率方面,体重为W(40-45g)的雌虾孵化成功率最低,体重为W(≥50g)的最高,由高到低位W(≥50g)W(≤40g)W(45-50g)W(40-45g);雄虾由高到低为:W(≥45g)W(45-50g)W(40-45g)W(≤35g)。但总体受精率和孵化率比其它学者报道的结果低许多,分析原因可能是:1、育苗期间水温太高,育苗期间水温均达到29℃以上,其中在实验期,水温达到30-31℃,高于最适育苗温度。同时,孵化所用桶体积较小(100L),且由于水温太高,孵化过程中常发现水面有油状物漂浮,导致孵化桶的水质极易变差。2、亲虾在繁殖期间,营养摄入的不够。随着繁殖周期逐渐变长,性腺中存储的能够转移给卵子营养物和能量越来越少,当摄入营养跟不上的时候,就容易导致卵子质量下降,直接使得授精率和孵化率下降。2.本试验利用第一章节人工授精培育的10个子代家系作为实验材料,在两种盐度(盐度32和盐度2)养殖中生长性能对比的研究,分析各个家系两种盐度中生长性能的表现差异,结果表明:各个家系之间表现出不同的日均增重率,其中家系5最高、家系1最低,家系5为家系1的7倍左右,各家系日均增重率由高到低分别为:家系5家系9家系6家系3家系10家系8家系7家系4家系2家系1;家系5和家系9表现出较优的生长特性,日均增重率率分别达到21.91%和18.43%,家系6和家系7在低盐度中的日均增重率高于其在海水中的值,说明家系6、7在低盐度中相比于高盐度更具有生长优势。在两种盐度下的成活率对比,发现除了家系2之外,低盐组的成活率普遍较高盐度组低,且在两种盐度中,其成活率存在显著性差异。对比在不同阶段特定生长率:在0-44d的养殖日龄高、低盐度组均为快速生长时期,但高盐度组其特定生长率高于低盐度组;在44d养殖日龄之后,各家系的生长放缓,进入稳定生长时期,低盐度组各家系的特定增重率开始高于高盐度组。其中,家系5、9在两种盐度下,各个时期的特定生长率都大于其它家系,其生长性能在各个阶段都优于其它各组。3.本试验选取ATP合成酶、Na~+-K~+-ATPase和Toll受体基因三对基因,对第二章中10个凡纳滨对虾家系的不同组织相对表达差异进行研究,并结合生长状况,分析在以后良种选育中的优缺点,结果表明:在低盐度中,家系4、5、6、7、8的ATP合成酶的相对表达量显著高于其它几个家系,且主要在肌肉中表达;家系1、2、3、9、10相对表达量则较低。鳃组织中Na~+-K~+-ATP酶的表达均高于高盐度组家系,其中家系5、6、7、9的表达相对较低,家系1、2、3、4的表达则相对较高。Toll基因表达上,家系1、2、3、8、10的表达量较高,说明机体受环境因子变化的影响较大,机体处于易感状态,家系5、6、7、9的表达量则较低,抗环境变化的能力与机体稳定性更强。家系5、6的ATP合成酶相对表达量高,Na~+-K~+-ATPase及Toll样受体基因表达低,结合其生长性能,说明家系5、6机体合成大量的ATP,且主要用于机体的生长;家系8在Na~+-K~+-ATPase及Toll样受体基因的表达都比较高,也说明机体消耗了大量能量在渗透压调节和机体免疫过程中。高盐度组中,ATP合成酶表达高低主要情况为:家系4、5、6、7、8在ATP合成酶的表达量较高,不同于低盐度组,其主要在肝胰腺中表达,家系1、2、3、9、10的表达则相对较低。;高盐度组水体盐度为自然海水盐度,各家系Na~+-K~+-ATPase的表达量均比较低,机体无需消耗大量能量在渗透压调节中;在Toll样受体基因总体的表达上,家系4、5、6、8的表达量相对较低,家系7、9、10的表达较高。同样在不分配太多能量到调节渗透压的高盐度组中,家系5、6、7、8、合成大量ATP,Toll受体表达低的情况下,家系5、6将能量主要用于机体生长,故表现出较好生长性能;综上所述家系5、6在高低两种盐度中的能量利用都更加合理,其生长性能也更佳,可以作为具有优异生长特性的家系进行后期的选择育种;家系6、7在低盐度组中,表现出比高盐度组更好的生长性能,可以作为选择更加适合淡水生长的家系进行良种选育。
【图文】：

组织表达,血淋巴,胰腺,对虾

(d)图 3-1 3 对引物在不同组织表达差异情况的检测(部分),上样 4ul a，图 b，图 c，图 d 分别是凡纳滨对虾 18S、LvToll、APT synthase 和 Na+/K+-ATP分别在肌肉、鳃、血淋巴和肝胰腺中的扩增结果Fig.3-1 Discrepancy in different tissues of 3 genes expression，Sample volume 4.0μLFig a,b,c,dis the PCR amplification result in mouscle,gill, hemolymph, hepatopancreasof 18LvToll,APT synthase and Na+/K+-ATPase，，respectively从扩增结果可知，大部分 cDNA 都反转录成功，个别没有条带的需重新 RNA 或重新进行 cDNA 的反转录。3 荧光定量 PCR 标准曲线如图 3-2 所示，图 a，图 b，图 c，图 d 分别是 18S、LvToll、APT 合成酶a+-K+-ATPase 对部分样品的荧光电量 PCR 扩增溶解曲线图，均只有个峰知其没有非特异性扩增片段。

溶解曲线,合成酶,荧光定量PCR,基因

(c) (d)图 3-2a,b,c,d 分别为 18S、LvToll、APT 合成酶和 Na+-K+-ATPase 基因荧光定量 PCR 的溶解曲线Fig.3-2 a,b,c,d is the melting curves of quantitative PCR amplification of 18S、LvToll、APTsynthase and Na+-K+-ATPase, respectively3.4 凡纳滨对虾 3 种不同 mRNA 基因在各组织中的表达图3-3、图3-4、图3-5分别显示了三个不同基因在不同组织中的差异性表达，通过差异性表达的结果，并结合第三章生长性能的的不同，进行综合分析。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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