欧李果实糖积累相关基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-05-01 21:45

【摘要】：欧李是一种综合利用价值极高的新型果树资源,属于蔷薇科樱桃属树种。含糖量是评价欧李果实品质的主要指标之一,直接影响到果实的食用价值和商品价值,也是当前欧李育种重要的品质指标。因此,对欧李果实糖积累生理和分子生物学机制的研究,可为提高果实品质、加快育种进程提供理论依据。本研究根据转录组测序结果,分析了欧李果实发育过程中糖代谢相关基因的表达特性,研究了基因表达和糖代谢相关酶活性与糖积累之间的关系;利用基因克隆技术,获得12个糖代谢相关基因的全长CDS序列,并对它们的时空表达模式进行了分析;采用农杆菌介导法转化烟草,探索欧李ChSPS1、ChSS1和ChSS3基因在蔗糖合成中的作用。主要研究结果如下:1.以欧李'农大4号' 5个时期(花后80d、110d、117d、124d和131d)的果实为材料,测定了果实中可溶性糖含量的动态变化。结果表明:蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇和总糖含量随着果实的生长发育呈稳定增加的趋势;在果实成熟期的蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量分别.为:19.882mg·g-1FW(约占总糖含量的30%)、14.681 mg.g-1FW(约22%)、28.884mg·g-1FW(约44%)和2.364mg·g-1FW(约4%),说明该品种果实糖积累的主要形式是果糖。2.通过对欧李'农大4号' 5个发育时期(4-1A、4-2A、4-3A、4-4A和4-5A)果实进行I11umina测序,5个时期测序结果注释的序列数分别为26,870个、32,705个、32,745个、32,247个和31,228个,共找到27个与糖代谢相关基因的RPKM值,同时测定了果实中相关酶活性的动态变化。在欧李果实发育的前中期阶段(花后11Od),SC、vAINV、NINV、SDH和FK的酶活性及相应基因的表达水平较高,可溶性糖含量在这个时期均较低。随着果实的生长发育,相应的酶活性和基因表达降低,可溶性糖在这个阶段开始在液泡中积累。在果实成熟的最后两周,HT基因的表达上调,果糖和葡萄糖进入液泡积累起来;SPS和SS酶活性及相应基因表达水平升高,加快蔗糖的积累;可溶性总糖含量升高,果实的甜度增加。3.根据27个糖代谢基因的RPKM值,从中筛选出大量表达的12个基因,分别为:ChSPS1、ChSPS2、ChSS1、ChSS3、ChvAINV、ChNINV3、ChCWINV、ChHK1、ChFK2、ChSDH2、ChSUT4和ChSORT2。和利用序列组装的方法从转录组测序信息中获得它们的全长拼接序列,并设计引物。以欧李'农大4号'成熟期(花后124d)果实为材料,通过基因克隆的方法获得上述基因全长。ChSPSI基因编码1057个氨基酸,ChSPS2基因编码1059个氨基酸,ChSS1基因编码806个氨基酸,ChSS3基因编码640个氨基酸,ChvAINV基因编码686个氨基酸,ChNINV3基因序编码680个氨基酸,ChCWINV基因编码557个氨基酸,ChHK1基因序编码498个氨基酸,ChFK2基因编码555个氦基酸,ChSDH2基因编码367个氨基酸,ChSUT4基因编码499个氨基酸,ChSOT2基因编码538个氨基酸。进化树分析发现这些基因主要与樱桃、杏、李、桃、苹果、梨等蔷薇科树种具有较近的亲缘关系。4.以欧李'农大4号'的根、茎、叶、花和果实及果实的5个生长发育期为材料,利用荧光定量PCR技术对12个糖代谢相关基因的时空表达模式进行了分析,结果表明:这些基因在不同组织均有表达,存在空间表达特异性;它们在欧李果实生长发育不同阶段的荧光定量结果与转录组测序结果基本一致,说明转录组测序质量高。5.转录组测序结果中共发现3个ChSPS基因,ChSPS1的RPKM值最大,说明它在欧李果实的蔗糖合成中起主要作用;ChSS1和ChSS3基因的RPK]M值随果实蔗糖的积累呈相反的趋势。为进一步验证ChSPS1、ChSS1和ChSS3在欧李蔗糖合成中的作用,本研究成功构建了 3个过表达载体:pBI-ChSPS1、pBI-ChSS1和pBI-ChSS3,以及分别以ChSS1和ChSSS3为靶基因的2个RNAi干扰载体:pBI-ChSS1-RNAi和pBI-ChSS3-RNAi。6.通过农杆菌介导法将3个过表达载体转入烟草,经抗性筛选、PCR鉴定及GUS染色获得转化株系。ChSPS1基因在转基因烟草叶片中的相对表达量是对照的1624-4626倍,转基因烟草叶片中SPS酶活性升高为对照的1.15-1.55倍,蔗糖和总糖含量分别比对照增加了 0.353-0.876 mg.g-1FW 和 2.169-2.577 mg·g-1FW,可见ChSPS 基因在烟草叶片中促进蔗糖的积累。ChSS1在转基因烟草叶片中的相对表达量是对照的2692-4829倍,转基因烟草叶片中SS合成方向的酶活性升高为对照的1.10-1.26倍,蔗糖和总糖含量分别比对照增加了 0.489-0.768 mg.g-1FW和1.092-2.082 mg.g-1FW,可见ChSS1基因在烟草叶片中促进蔗糖的积累。ChSS3在转基因烟草叶片中的相对表达量是对照的890-1979倍,转基因烟草叶片中SS分解方向的酶活性升高为对照的1.37-1.94倍,蔗糖和总糖含量分别比对照降低了 0.625-0.958 mg.g-1FW和0.907-1.590 mg.g-1FW,可见ChSS3基因在烟草叶片中抑制蔗糖的积累。这些结果表明ChSS1和ChSS3在欧李果实蔗糖积累中起相反的作用。
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如在苹果叶片光合作用的早期产物中，，山梨醇约占总糖的８０％。山梨醇也是逡逑一种可溶性的贮存类碳水化合物，其生物合成和分解代谢是由多种不同的酶催化进行的逡逑（图１－２）邋［２３】：在蔷薇科植物叶片的细胞质中，叶绿体经光合作用后生成的磷酸丙糖，逡逑在相关酶的催化作用下生成６－a愃峁�糖（Ｆｍｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，邋Ｆ６Ｐ），Ｆ６Ｐ有两种去向：逡逑一是合成６－a愃崧固牵ǎ樱酰悖颍铮螅澹�６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｓ６Ｐ），进而生成鹿糖；二是生成６－a愃崞襄义咸烟牵ǎ牵欤酰悖铮螅澹�６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｇ６Ｐ），进而生成山梨醇。从而在蔷薇科植物中产生了鹿糖逡逑和山梨醇这两种不同的光合产物运输形式。山梨醇由叶片经韧皮部运输到果实等库组织逡逑后，不经转化直接以原形山山梨醇转运蛋白跨膜进入库细胞，然后转化分解为果糖或葡逡逑萄�

本文编号：2647092