光镊研究rpoS RNA自抑制茎环

发布时间：2020-04-05 20:12

【摘要】：生物大分子的结构及其动态变化是一切生命现象的物质基础。在分子水平上对生物大分子结构与功能进行研究,阐释生命现象的本质,对人类认知世界与自身都有重大意义。本论文系统地调研光镊技术研究单分子的不同实验方案,并针对多种分子生物学体系进行研究,在前人基础上提出本研究的目的和实验方法。取得主要研究成果如下:1.建立高精度、高稳定的光镊拉伸单分子实验装置。光镊对位移及外力的测量精度与系统的稳定性决定了适合研究的体系。为了提高原光镊系统的稳定性,本研究采取引入探测光以提高测量精度;利用对粘底微球的图像识别,实现反馈补偿系统漂移等多项措施,创造优良的系统稳定性。为顺利完成单分子测量,我们发展了单分子样品的制备、分子偶联等技术。2.研究rpoS RNA自抑制茎环结构。本文利用光镊对rpoS RNA的自抑制茎环进行拉伸得到了稳定重复的RNA“力-伸展”曲线。通过对RNA“力-伸展”曲线的分析,得到rpoS RNA自抑制茎环结构被打开的动力学过程,证实其three-way-junction结构,计算了RNA关键核心部分的自由能。实验发现镁离子明显提高了自抑制茎环核心部分的结合强度,由此推测镁离子会促使RNA结构变得更加紧密并改变茎环的空间取向。这一结构变化客观上拉近了D1和D2茎环之间的距离,方便Hfq蛋白帮助sRNA结合在SD区域上,从而解除基因表达的自抑制。3.研究GSK、Syntelin抑制CENP-E行走机理。光镊研究CENP-E行走的动力学特性,发现其平均运动速度低于kinesin-1蛋白,行走一段距离后会“休息”片刻。实验结果表明GSK阻断了CENP-E行走时ATP水解为ADP的过程,从而实现对CENP-E行走的抑制。依据实验现象,我们推测Syntelin是通过阻碍CENP-E·ADP从微管上解离,从而抑制了CENP-E运动。4.研究CENP-T与CENP-W蛋白间相互作用强度。本文提出了一种将CENP-T或CENP-W连接在DNA手柄一端,再通过手柄另一端偶联在微球上的方案。通过这一策略我们测量了CENP-T/W之间的断裂力,直接从单分子水平上研究磷酸化对CENP-T/W蛋白结合强度的影响。5.为了实现对流动细胞的动态相位成像,本文提出了一种基于单像素的相位成像方法。通过动态加载不同波矢的平面波采集物体的傅里叶频谱,借助逆傅里叶变换对物体的振幅与相位分布进行重构。实验测试了二值化相位分布与连续相位分布,均得到良好的重构效果。本文建立了高精度、高稳定性的光镊研究生物单分子力学特性实验平台,并通过一系列生物物理交叉问题的研究证实了这一平台在生命科学领域的价值。研究取得的结果在生命科学基本问题、医学应用等方面都具有一定贡献,为使用光镊进行深入的分子生物学研究奠定了基础。
【图文】：

１．１．２微针－光镊法逡逑２００８年Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ等人在研究核糖体时使用了微针－光镊实验方法＿，方逡逑法如图１－２邋（ａ）所示。待研宄的分子处于被微针固定的微球与光镊捕获的微球逡逑之间，这种方案能在样品室较深的位置进行实验，避免了样品室底面引起的偏逡逑差。而且该方法对于微球的固定比粘连在样品室底面更加牢固，是目前单分子逡逑光镊领域中常用的做法。逡逑１．１．３双光镊与多光镊法逡逑双光镊法也是一种常用的单分子研宄策略。如图１－２邋（ｂ）所示，待研究分逡逑子两端的微球使用两束独立的光镊进行捕获，分子上的外力通过控制其中一个逡逑光阱的位置来完成。双光镊系统中实验区域不仅距离样品室底面较远，同时样逡逑品室（或微针）机械漂移不会对实验带来影响，两个光镊的位置都只与物镜有逡逑关，因此无论是拉伸还是恒力模式＾１６］，都能很好地驾驭。逡逑⑷■逦（ｂ）逦ｓｍｗ逡逑ＰＩ逦yU一逡逑W：

（ａ）图为微纳加工的单分子光镊示意图。（ｂ）图为高通量单分子光镊进行ＤＮＡ逡逑拉伸的示意与实验图像。逡逑ｎＳＷＡＴ进行ＤＮＡ拉伸如图１－３邋（ｂ）所示，先向样品室中输入中间偶联有逡逑ＤＮＡ的微球样品溶液，很多微球被阵列光阱捕获。然后通入缓冲液，清洗掉中逡逑间没有连接ＤＮＡ的单个微球与样品残余液体，最后通过移动光阱阵列的位置逡逑拉伸微球间的ＤＮＡ分子。这种光镊设备一次可以同时进行几十到上百个分子逡逑的拉伸，补充了传统单分子光镊中一次只能对一个分子拉伸的不足；ｎＳＷＡＴ的逡逑功率低，能量利用非常高效；特别是这种芯片式的光镊不存在机械漂移，非常逡逑稳定，该仪器也容易和荧光显微技术等相结合。逡逑１．１．５荧光光镊逡逑荧光成像是生命科学研宄中常用的手段，荧光与光镊的结合使得研宄中，，逡逑在获得分子力谱的同时也能得到荧光标记分子的位置信息［２２＿２４］。Ｉｓｈｉｉ等人结合逡逑？邋光镊、全内反射焚光显微镜（Ｔｏｔａｌ邋Ｉｎｔｅｒｎａ丨邋Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，逡逑ＴＩＲＦ）与荧光显微镜研宄了肌球蛋白沿肌动蛋白运动的精细过程［２５］。光镊与逡逑４逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q752

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本文编号：2615478