EAAT3敲减rAAV载体的构建及其海马注射对小鼠认知的影响

发布时间：2020-05-19 19:03

【摘要】：兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporter,EAATs)是一种 Na+依赖性兴奋性氨基酸转运体,主要功能是调控细胞内外兴奋性氨基酸的浓度,研究发现EAAT3表达下降与海马相关的学习认知功能损害存在相关性。重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)作为质粒穿梭载体具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定、物理性质稳定等优点,是一种有效的基因传递载体系统。短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)在细胞内可被核酸酶切割成双链siRNA,与目标mRNA靶点结合后促使靶mRNA的降解,也是一种被广泛应用的基因调控工具。虽然已有研究发现若干有关EAAT3功能调节途径,但尚未发现高选择性性的化合物,本研究拟通过构建能表达shRNA的rAAV载体,建立一种敲减小鼠海马EAAT3表达的动物模型,为进一步研究EAAT3调控机制和相关分子信号通路打下研究基础。第一部分EAAT3敲减rAAV载体的构建、鉴定及筛选目的构建EAAT3敲减rAAV及其对照rAAV,以作为EAAT3敲减模型的基础。方法基于 SLC1A1(solute carrier family 1 member 1)基因 mRNA 序列设计 4 条 shRNA编码基因 mSLC1A1-1、mSLC1A1-2、mSLC1A1-3、mSLC1A1-4 和 1 条阴性对照序列NC,与酶切后的pAAV-U6-EGFP载体质粒连接、转化,挑取阳性质粒进行测序鉴定。将测序正确的重组质粒、pHelper包装质粒和pAAV-DJ辅助质粒共同转染至AAV-293 细胞包装得到 rAAV-shRNA-SLC1A1-1-EGFP、rAAV-shRNA-SLC 1A1-2-EGFP、rAAV-shRNA-SLC 1A1-3-EGFP、rAAV-shRNA-SLC1A1-4-EGFP、rAAV-shRNA-NC-EGFP 这 5 种 rAAV。用所得 rAAV侵染HT-22细胞,72h后RT-qPCR检测SLC1A1 mRNA表达水平。结果重组质粒经测序鉴定,插入位置和序列与设计一致,成功构建了重组干扰质粒;经有限梯度稀释法鉴定计数重组感染滴度约为1×1013TU/ml;2-A△Ct法分析SLC1A1基因相对表达量与NC组相比,mSLC1A1-3组差异无统计学意义,mSLC1A1-1组、mSLC1A1-4组SLC1A1表达量下降(P0.01),mSLC1A1-2组表达量最低约为NC组的 42%(P0.01)。结论成功构建了 EAAT3敲减rAAV,其中干扰序列为“GCTGATCGTATCCAGCATGAT”(5'-3')的腺相关病毒rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP抑制EAAT3表达的效果最佳。第二部分小鼠海马注射rAAV敲减EAAT3效果的检验目的检测小鼠海马注射rAAV后EAAT3表达水平的变化,实现EAAT3敲减模型的构建。方法72只成年C57小鼠随机分为6组,每组12只,予海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP 病毒液 1 μ 1/侧(1 × 1013 TU/ml),分别于注射后即刻、24h、7d、14d、21d、28d取双侧海马组织,每组随机抽取6只分别行RT-qPCR和Western blot检测EAAT3表达水平。结果与对照组CON组相比,小鼠海马EAET3表达量随时间持续而下降,两种实验结果的基本趋势相同;在海马注射后第21d,mRNA表达量下降至对照组的43.1%(P=0.043),蛋白表达量降至37.4%(P0.01);注射后第28d,转录和翻译产物分别下降到对照组的30%和25%(P0.01)。结论rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP海马注射可有效敲减成年小鼠海马EAAT3的表达,其中在注射后28d表达量最低。第三部分海马注射rAAV对LPS致认知障碍小鼠行为学的影响目的利用脑室注射LPS致认知功能障碍小鼠模型,观察海马注射rAAV后对小鼠认知相关行为学的影响。方法10周龄C57小鼠48只,随机分为数量均等的4组。分别为阴性对照组(NC组)、EAAT3敲减组(RNAi组)、认知障碍组(LPS组)、认知障碍+EAAT3敲减组(LPS+RNAi组)。NC组和LPS组双侧海马注射对照病毒液1 μ L/侧,RNAi组和LPS+RNAi组双侧海马注射效应病毒液1 μ L/侧(1 × 1013 TU/mL)。21d后NC组和RNAi组侧脑室注射 aCSF 2 μ L,LPS 组和 RNAi+LPS 组侧脑室注射 LPS 溶液 2 μ L(1000ng/μ L)。所有动物海马注射后第15d进行旷场实验,第16d水迷宫空间获得性训练5天;21d行侧脑室注射,侧脑室注射后1-3d进行空间探索测试和工作记忆测试,结果 旷场实验各组动物移动距离和运动总时比较差异没有统计学意义;水迷宫空间获得性训练各组小鼠登台潜伏期(s)从第1天到第4天逐渐缩短,训练第4、5天潜伏期时长较第1天相比,潜伏期时长差异有统计学意义(P=0.024);空间探索测试各组小鼠游泳总距离和平均速度之间差异无统计学意义;穿台数NC组高于其他各组且具有统计学意义(P=0.034),其他各组相比较差别无统计学意义;进入目标象限次数NC 组高于 RNAi 组和 LPS+RNAi 组(P=0.037),LPS 高于 LPS+RNAi 组(P=0.037)。工作记忆测试第1天NC登台潜伏期低于LPS+RNAi组(P=0.029)。结论敲减小鼠海马EAAT3可降低小鼠在行为学测试中的表现,并可加重LPS所致认知障碍。
【图文】：

图１－２有限稀释荧光计数法测定ａＡＡＶ滴度约为１邋ｘｌ0ｉ３ＴＵ／ｍｌ。图中标尺长度为５０邋ｗ邋ｍ逡逑３．邋ＲＴ－ｑＲＣＲ检测ＨＴ－２２细胞ＥＡＡＴ３表达：２－ＡＡＱ法分析ＥＡＡＴ３基因与内参ＧＡＰＤＨ逡逑的相对表达量；与ＮＣ组相比（图１－３），邋ｍＳＬＣｌＡｌ－３组差异无统计学意义（＾＝０．９７３１），逡逑ｍＳＬＣｌＡｌ－１邋组、ｍＳＬＣｌＡｌ－４邋组邋ＥＡＡＴ３邋表达量约为邋ＮＣ邋组的邋６２．９％和邋６９．７％（Ｐ＜０．０１邋），逡逑ｍＳＬＣｌＡｌ－２组表达量最低，约为ＮＣ组的４２％邋（Ｐ＜０．０１）。逡逑￡邋１．５－逡逑Ｉ一邋ａ逡逑ｍＳｍ逡逑逦１逦逡逑ｖｖｖｖ’逡逑图丨－３ＨＴ－２２细胞ＳＬＣ１Ａ１基因相对表达量。结果表示为均数土标准差（ｎ＝３），邋Ｔ＜０．０１，与逡逑ＮＣ组比较。逡逑讨邋论逡逑兴奋性氨基酸转运体３邋（ＥＡＡＴ３）是兴奋性氨基酸转运体５个亚型中的一种，主逡逑２５逡逑

在海马注射后第２１ｄ，邋Ｄ２１组相对表达量约为ＣＯＮ组的４３．１％，尸＝０．０４３；注射后第逡逑２８ｄ，Ｄ２８组相对表达量降至ＣＯＮ组的３０％，尸＜０．０１；其余Ｄｌ、Ｄ７、Ｄ１４组表达量逡逑下降差异无统计学意义（图２－１）。逡逑￡邋２．５－１逡逑＜逡逑Ｐ邋２．０－逡逑ＩＩＩ逡逑Ｚ．邋１．５－逦ｔ逡逑ｉ１0邋ＩＩ邋Ｌ逦ａ逡逑ｄＭ．ｉｉ逡逑Ｅ逦ＣＯＮ邋Ｄ１邋Ｄ７邋Ｄ１４逦Ｄ２１逦Ｄ２８逡逑图２－１邋ＲＴ－ｑＰＣＲ检测海马ＥＡＡＴ３相对表达量。结果表示为均数士标准差（ｎ＝６），邋ａＰ＜０．０５，，ＡＰ＜０．０１，逡逑与ＣＯＮ组比较）逡逑２．逦ＷＢ检测海马ＥＡＡＴ３蛋白相对表达量：统计ＥＡＡＴ３与内参ＧＡＰＦＨ条带灰度逡逑值比值，即ＥＡＡＴ３／ＧＡＰＤＨ蛋白相对表达量；与对照组ＣＯＮ组相比，注射后２４ｈ海逡逑马组织相对表达下降无统计学意义，Ｐ＝0．３２６；Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８各组蛋白相对表逡逑达较ＣＯＮ组明显降低，其中２１ｄ、２８ｄ表达量约为对照组的３７．４％和２５％，户＜０．０１。逡逑（图邋２－２）。逡逑３３逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;R614

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本文编号：2671336