玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析

发布时间：2022-02-20 13:59

　　玉米（Zea mays L.）作为世界上分布最广泛的作物之一,其用途广泛,不仅可以作为人类口粮,还可以作为牲畜饲料及工业生产原料。由于居民饮食结构中肉类的比例逐渐上升,极大地促进了养殖业的发展。随着养殖业的快速发展,对饲料的需求逐年攀升。玉米还可用于工业原料,生产淀粉,氨基酸和乙醇等,这带动了玉米种植面积和总产量的稳步上升。然而在世界范围内玉米需求仍在持续增长,但供给情况并不乐观。因此积极展开玉米的分子遗传学研究,为玉米遗传育种工作提供材料和基因资源,就显得十分必要和迫切。然而玉米的分子遗传学研究离不开转基因和大量的突变体材料。另外玉米的株型较大不适合大规模温室生长,生长周期较长等特点限制了玉米基因功能研究的发展。二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）与大麦,小麦,玉米等禾本科作物亲缘关系较近,它们都是单子叶植物,另外二穗短柄草的基因组小,生长周期短,生长条件也简单及自花授粉等特点使其成为了研究禾本科单子叶植物的模式材料。为了更好地开展玉米功能基因组学研究,本文致力于建立高效,可重复的玉米遗传转化体系和Ac/Ds标签突变体库,创造大量突变体材料,为玉米基因的... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：120 页

【学位级别】：硕士

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符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 玉米简介
    1.2 玉米遗传转化技术的发展
        1.2.1 原生体法
        1.2.2 基因枪法
        1.2.3 电击法、碳化硅晶体法和气溶胶注射法
        1.2.4 农杆菌法
    1.3 玉米转座子
        1.3.1 玉米转座子的发现
        1.3.2 转座子的类型
            1.3.2.1 Ac/Ds转座子系统
            1.3.2.2 Mu转座子系统
            1.3.2.3 En/Spm转座子系统
    1.4 玉米突变体的发展现状
        1.4.1 理化诱变技术
        1.4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑法
        1.4.3 插入诱变
            1.4.3.1 T-DNA插入法
            1.4.3.2 转座子标签法
    1.5 SOC1 基因调控植物开花的研究现状
    1.6 本课题的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料及其生长条件
        2.1.2 质粒与菌株
        2.1.3 酶及生化试剂
        2.1.4 引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 玉米遗传转化相关表达载体的构建
            2.2.1.1 感受态的制备
            2.2.1.2 植物总RNA的提取
            2.2.1.3 cDNA反转录
            2.2.1.4 Pfu高保真酶PCR扩增
            2.2.1.5 胶回收
            2.2.1.6 TA克隆
            2.2.1.7 转化大肠杆菌
            2.2.1.8 提取质粒
            2.2.1.9 将克隆的DNA目的片段连接到植物表达载体
            2.2.1.10 转化大肠杆菌
            2.2.1.11 提取质粒(试剂盒法)
            2.2.1.12 农杆菌AGL1或EHA105 的转化
        2.2.2 基因枪法转化玉米
            2.2.2.1 诱导愈伤
            2.2.2.2 基因枪质粒制备
            2.2.2.3 基因枪微弹的制备
            2.2.2.4 基因枪设备
            2.2.2.5 基因枪轰击玉米愈伤组织
            2.2.2.6 GFP阳性幼苗的再生
            2.2.2.7 GFP阳性植株的分子分析
            2.2.2.8 GFP阳性植株的F1 代分析
        2.2.3 农杆菌介导的玉米遗传转化
            2.2.3.1 农杆菌侵染液的准备
            2.2.3.2 幼胚的处理
            2.2.3.3 侵染与共培养处理
            2.2.3.4 恢复培养
            2.2.3.5 GFP阳性幼苗的再生
            2.2.3.6 GFP阳性植株的PCR和 RT-PCR分析
            2.2.3.7 Southern杂交
            2.2.3.8 GFP阳性植株的F1 代分析
        2.2.4 玉米Ac/Ds突变体库的构建与分析
            2.2.4.1 转基因系T0代Ac转座酶基因的表达分析
            2.2.4.2 玉米DNA的提取(试剂盒法)
            2.2.4.3 T-DNA定位
            2.2.4.4 转基因系T0代fDs的体细胞转座分析
            2.2.4.5 fDs插入突变植株的鉴定与富集
            2.2.4.6 fDs新插入位置的定位分析
        2.2.5 二穗短柄草SOC1-like(BdSOC1-like)功能的初步分析
            2.2.5.1 序列比对及进化分析
            2.2.5.2 qRT-PCR分析
            2.2.5.3 BdSOC1-like超表达载体(BdSOC1-like-ox)的构建
            2.2.5.4 二穗短柄草的遗传转化
            2.2.5.5 PCR
            2.2.5.6 pXQD17 阳性后代的遗传分析
            2.2.5.7 开花时间分析
            2.2.5.8 种子特点分析
        2.2.6 统计分析
3 结果与分析
    3.1 本研究相关表达载体的构建
    3.2 玉米遗传转化
        3.2.1 基因枪法转化玉米
            3.2.1.1 GFP辅助筛选抗性愈伤和抗性芽及植株
            3.2.1.2 基因枪法介导的玉米转化频率
            3.2.1.3 GFP阳性植株的分子鉴定
            3.2.1.4 GFP阳性植株中GFP的拷贝数分析
            3.2.1.5 GFP阳性植株的F1 代分析
        3.2.2 农杆菌介导的玉米转化
            3.2.2.1 两种共培养法(DC和 MC)对玉米瞬时转化效率的影响对比
            3.2.2.2 T0 GFP阳性幼苗的再生及初步分析
            3.2.2.3 两种共培养法(DC和 MC)对玉米再生和稳定转化效率的影响
            3.2.2.4 GFP阳性植株的F1 分析
    3.3 玉米Ac/Ds突变体库的构建与分析
        3.3.1 pXQD70 阳性植株的T0 分析
            3.3.1.1 Ac转座酶基因的表达分析
            3.3.1.2 T0 体细胞fDs转座分析
        3.3.2 pXQD70 阳性株系后代的筛选
        3.3.3 F1 fDs转座印迹分析
        3.3.4 非连锁转座的大规模富集
        3.3.5 fDs插入位置在染色体上的分布
        3.3.6 突变体表型分析
    3.4 BdSOC1-like基因功能的初步分析
        3.4.1 BdSOC1-like基因的生物信息学分析及分子克隆
        3.4.2 BdSOC1-like的空间表达分析
        3.4.3 BdSOC1-like的表达并没有昼夜节律性
        3.4.4 冷处理对BdSOC1-like mRNA水平的影响
        3.4.5 BdSOC1-like超表达(BdSOC1-like-ox)阳性株系T0 的分子分析
        3.4.6 BdSOC1-like-ox阳性株系T1 后代的分离分析
        3.4.7 BdSOC1-like超表达能促进植物的成花转变
        3.4.8 超表达BdSOC1-like产生了多效性表型
4 讨论
    4.1 在玉米的遗传转化中,GFP荧光是一种可靠的可视化标签
    4.2 干滤纸共培养法能显著提高玉米的转化效率
    4.3 有效的玉米遗传转化系统仍然需要改善
    4.4 Ac/Ds系统的工作情况
    4.5 BdSOC1-like基因功能的初步研究
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3635191