miR-20a-5p调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证

发布时间：2022-02-22 12:15

　　目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）报告载体中,并与miR-20a-5p的模拟物或阴性对照共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶实验和GFP抑制实验检测荧光素酶活性及GFP阳性细胞比例,确定miR-20a-5p与靶基因的靶向关系。结果:通过生物信息学预测到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物种的Smad7基因3′UTR区都有保守的结合种子序列;荧光素酶、GFP报告基因及点突变载体经PCR及测序鉴定均正确;双荧光素酶活性检测结果显示:miR-20a-5p显著降低Smad7 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性;GFP抑制实验及流式细胞仪检测结果显示:miR-20a-5p可以显著降低GFP阳性细胞的比例。结论:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad7 3′UTR的种子序列,提示其可能通过直接靶向Smad7基因来发挥促进成骨分化的调控作用。 

【文章来源】：天津医科大学学报. 2020,26(03)

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 细胞培养
        1.2.2 cDNA的获取
        1.2.3 靶基因的预测
        1.2.4 miR-20a-5p靶基因荧光报告载体的构建
        1.2.5 miR-20a-5p靶基因绿色荧光（GFP）报告载体的构建
        1.2.6 双荧光素酶检测
        1.2.7 GFP抑制实验
    1.3 统计学方法
2 结果
    2.1 miR-20a-5p靶基因预测
    2.2 荧光素酶报告基因载体的构建
    2.3 GFP报告基因载体的构建
    2.4 双荧光素酶活性检测
    2.5 GFP抑制实验
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证[J]. 王珊,李晓霞,周杰,王宝利.  天津医药. 2016(09)
[2]骨质疏松发病机制研究进展[J]. 张月红.  解放军预防医学杂志. 2004(02)



本文编号：3639423