胰酶消化及肝细胞生长因子对间充质干细胞增殖影响的研究

发布时间：2022-07-09 17:39

　　间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是细胞治疗和组织工程产品重要的种子细胞之一,由于从机体组织中获取的MSCs数量有限,故需要进行体外扩增。MSCs体外扩增受多种因素影响,如培养基成分、培养过程中的操作参数等。采用传统的含血清培养基扩增MSCs,无法满足临床应用的要求;而现有的化学成分明确的无血清培养基（Serum free medium,SFM）支持MSCs增殖的能力有限。针对上述问题,本文以人脐带来源的MSCs为研究对象,考察在无血清培养条件下胰酶浓度及消化时间对细胞收获及继代培养的影响,探究培养基关键组分肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）对MSCs体外增殖的作用及潜在机制,以改善自制成分明确的SFM的促细胞增殖能力。研究结果表明,与含血清培养基相比,在商业化SFM和自制的SFM中MSCs的增殖和连续传代能力较弱;低浓度、短时间的胰酶消化处理不利于细胞收获;而高浓度、长时间的胰酶消化处理破坏细胞表面整合素β1,导致细胞周期的延滞,从而对MSCs继代培养时的黏附和增殖产生不良影响,因此选择0.25%胰酶消化3 ... 

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
附录
第1章 前言
    1.1 再生医学与干细胞
        1.1.1 再生医学与干细胞
        1.1.2 干细胞分类与应用
    1.2 间充质干细胞的特性
        1.2.1 间充质干细胞来源
            1.2.1.1 骨髓
            1.2.1.2 脂肪
            1.2.1.3 脐带
        1.2.2 间充质干细胞的应用
    1.3 间充质干细胞的体外扩增
        1.3.1 细胞分离
        1.3.2 细胞培养
            1.3.2.1 培养方式
            1.3.2.2 培养基
        1.3.3 细胞收获
    1.4 培养基关键组分对MSCs生物学行为的调节
        1.4.1 无血清培养基的组分
            1.4.1.1 糖类
            1.4.1.2 氨基酸
            1.4.1.3 脂质
            1.4.1.4 维生素
            1.4.1.5 无机盐
            1.4.1.6 细胞因子
        1.4.2 调节MSCs增殖的信号途径
            1.4.2.1 MAPK途径
            1.4.2.2 PI3K途径
            1.4.2.3 NF-κB途径
            1.4.2.4 JAK/STAT途径
        1.4.3 无血清培养基的研究现状及存在问题
    1.5 课题提出
第2章 培养基和胰酶消化对MSCs增殖的影响
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 生长培养基的配制
        2.2.2 MSCs的培养
        2.2.3 MSCs的传代
        2.2.4 细胞形态学观察
        2.2.5 细胞贴壁检测
        2.2.6 细胞增殖检测
        2.2.7 生长曲线测定
        2.2.8 细胞存活率检测
        2.2.9 细胞周期检测
        2.2.10 Western blot检测
        2.2.11 细胞表面表型检测
        2.2.12 成骨诱导分化
        2.2.13 成脂诱导分化
        2.2.14 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 含血清培养基中MSCs的生长和分化
            2.3.1.1 MSCs的形态与增殖
            3.3.1.2 MSCs的传代培养
            2.3.1.3 MSCs的表面表型
            2.3.1.4 MSCs诱导分化
        2.3.2 无血清培养条件下MSCs的生长和传代
            2.3.2.1 MSCs的贴壁
            2.3.2.2 MSCs的增殖
            2.3.2.3 MSCs的连续传代
        2.3.3 胰酶浓度和消化时间对MSCs继代培养的影响
            2.3.3.1 胰酶浓度和消化时间对MSCs细胞收获的影响
            2.3.3.2 胰酶浓度和消化时间对MSCs贴壁的影响
            2.3.3.3 胰酶浓度和消化时间对MSCs增殖的影响
            2.3.3.4 胰酶浓度和消化时间对MSCs整合素表达的影响
            2.3.3.5 胰酶浓度和消化时间对MSCs细胞周期的影响
            2.3.3.6 培养基对胰酶消化的MSCs增殖的影响
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第3章 HGF对MSCs增殖的调节作用及机制
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 无血清培养基的配制
        3.2.2 MSCs的培养
        3.2.3 MSCs的传代
        3.2.4 细胞形态学观察
        3.2.5 细胞贴壁检测
        3.2.6 细胞增殖检测
        3.2.7 FAK抑制剂配制
        3.2.8 AKT抑制剂配制
        3.2.9 细胞周期检测
        3.2.10 Western blot检测
        3.2.11 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 HGF对MSCs增殖的影响
            3.3.1.1 HGF浓度对MSCs增殖的影响
            3.3.1.2 HGF对MSCs贴壁的影响
            3.3.1.3 HGF对MSCs增殖的影响
            3.3.1.4 HGF对MSCs细胞周期的影响
        3.3.2 HGF促进MSCs增殖的相关机制
            3.3.2.1 HGF对MSCs增殖相关信号通路及整合素表达的影响
            3.3.2.2 HGF对AKT信号通路的影响
        3.3.3 HGF在FAK-AKT-mTOR信号通路及整合素表达中的作用
            3.3.3.1 PF对MSCs增殖的影响
            3.3.3.2 PF对FAK-AKT-mTOR信号通路及整合素表达的影响
            3.3.3.3 LY对MSCs增殖的影响
            3.3.3.4 LY对FAK-AKT-mTOR信号通路及整合素表达的影响
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第4章 HGF对MSCs细胞特性的影响
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 无血清培养基的配制
        4.2.2 MSCs的培养
        4.2.3 细胞形态学观察
        4.2.4 细胞增殖检测
        4.2.5 生长曲线检测
        4.2.6 表面表型检测
        4.2.7 基因表型检测
        4.2.8 成骨诱导分化
        4.2.9 成脂诱导分化
        4.2.10 统计学分析
    4.3 结果
        4.3.1 HGF对MSCs形态的影响
        4.3.2 HGF对MSCs增殖的影响
        4.3.3 HGF对MSCs传代的影响
        4.3.4 HGF对MSCs表面表型的影响
        4.3.5 HGF对MSCs干性基因表达的影响
        4.3.6 HGF对MSCs成骨分化潜能的影响
        4.3.7 HGF对MSCs成脂分化潜能的影响
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第5章 全文总结与展望
参考文献
致谢
硕士期间研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]CD73对骨髓间充质干细胞增殖与衰老的影响[J]. 王琰,李琼,张三林,郭志坤.  解剖学报. 2017(06)
[2]动物细胞无血清培养基的研究与设计方法[J]. 王永民,陈昭烈.  中国生物工程杂志. 2007(01)



本文编号：3657541