乳二糖磷酸化酶的表达与优化

发布时间：2022-10-15 13:20

　　乳二糖（lacto-N-biose,LNB）是母乳寡糖中的重要组成部分,也是双歧杆菌维持生命活动的重要底物,它在促进婴幼儿肠道中双歧杆菌的定植和增殖中起重要作用。双歧杆菌可以通过乳二糖磷酸化酶（lacto-N-biose phosphorylase,LNBP）来代谢LNB获得生命活性所需要的能量。LNBP（EC2.4.1.211）是一种可逆的磷酸化酶,可以催化LNB和GNB（galacto-N-biose）产生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）,N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和β-D-半乳糖-1-磷酸（Gal 1-P）。Wada等证实双歧杆菌中具有编码代谢LNB的基因簇,其中LNB通过特定的ABC型转运蛋白转运至细胞质,它由LNBP最终在糖酵解和氨基糖代谢途径中代谢。从长双歧杆菌JCM 1217（Bifidobacterium longum JCM1217）克隆乳二糖磷酸化酶基因,将该基因与载体pET28a连接构建了重组表达质粒pET28a-LNBP,将pET28a-LNBP转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中构建了重组工程菌株E.coli BL21/pET28a... 

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 乳二糖磷酸化酶
        1.1.1 乳二糖磷酸化酶概述
        1.1.2 乳二糖磷酸化酶的应用
        1.1.3 乳二糖磷酸化酶的研究进展
    1.2 蛋白表达系统
        1.2.1 原核表达系统
        1.2.2 真核表达系统
    1.3 本论文研究的主要内容及意义
        1.3.1 研究目的及意义
        1.3.2 研究内容
第二章 LNBP在大肠杆菌中的表达
    2.1 实验材料与设备
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 培养基及培养条件
        2.1.3 主要试剂及试剂的配制
        2.1.4 主要仪器与设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
        2.2.2 重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的验证
        2.2.3 重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的表达
        2.2.4 粗酶液的制备
        2.2.5 SDS-PAGE电泳检测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 重组菌E.coli BL21/pET28a-LNBP的构建
        2.3.2 重组LNBP在大肠杆菌BL21 中的表达
    2.4 本章小结
第三章 LNBP在大肠杆菌中的表达条件优化
    3.1 实验材料与设备
        3.1.1 菌株
        3.1.2 培养基及培养条件
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器与设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 诱导条件的优化
        3.2.2 显著性分析
        3.2.3 LNBP酶活性的测定
        3.2.4 蛋白含量的测定及SDS-PAGE分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 Gal1-P浓度的标准曲线
        3.3.2 初始菌密度对重组LNBP表达的影响
        3.3.3 IPTG浓度对重组LNBP表达的影响
        3.3.4 诱导温度对重组LNBP表达的影响
        3.3.5 诱导时间对重组LNBP表达的影响
        3.3.6 振荡培养的转速对重组LNBP表达的影响
        3.3.7 正交试验
    3.4 本章小结
第四章 LNBP工程菌的构建及在枯草芽孢杆菌中的表达优化
    4.1 实验材料与设备
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要试剂及配置
        4.1.3 主要仪器与设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 LNBP基因的克隆
        4.2.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化
        4.2.3 重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP的验证
        4.2.4 LNBP的表达和纯化
        4.2.5 诱导条件的优化
        4.2.6 LNBP酶活性的测定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 Gal1-P浓度的标准曲线
        4.3.2 LNBP的扩增
        4.3.3 双重消化表达载体和PCR产物
        4.3.4 重组菌B.subtilis WB800N/pHT43-LNBP在平板上的生长情况
        4.3.5 重组LNBP在枯草芽孢杆菌中的表达
        4.3.6 诱导时间对重组LNBP表达的影响
        4.3.7 诱导温度对重组LNBP表达的影响
        4.3.8 振荡速度对重组LNBP表达的影响
        4.3.9 初始细胞密度对重组LNBP表达的影响
        4.3.10 IPTG浓度对重组LNBP表达的影响
    4.4 本章小结
第五章 LNBP的纯化及部分酶学性质分析
    5.1 实验材料与设备
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 主要试剂及试剂的配制
        5.1.3 主要仪器与设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 重组LNBP的纯化
        5.2.2 重组LNBP的部分酶学性质分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 重组LNBP的纯化
        5.3.2 重组LNBP的最适反应温度
        5.3.3 重组LNBP的最适pH
    5.4 本章小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表文章
攻读硕士期间申请国家发明专利


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3691381