基于CRISPR/Cas9技术改造酿酒酵母合成D-阿洛糖的研究

发布时间：2022-12-17 14:35

　　近年来,D-阿洛糖（D-Allose）由于其具防止肥胖、抗氧化、抗高血压、抗肿瘤以及抗癌症功能,而受到越来越多的关注。目前,以Izumoring酶法指导生产D-阿洛糖的研究较为广泛。相比于以D-阿洛酮糖为底物,利用D-果糖为原料,经D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase,DPE）和L-鼠李糖异构酶（L-rhamnose isomerase,LRI）作用生产高附加值D-阿洛糖,将成为更加认可的生产路线。酿酒酵母一直被美国FDA（Food and Drug Administration）认为是GRAS（Generally Recognized As Safe）生产菌株,具备安全无致病性、遗传背景清晰、培养简单和繁殖迅速等优势,因此以酿酒酵母为宿主生产D-阿洛糖在确保食品安全性等方面具有相当大的优势。由于酿酒酵母体内的己糖激酶同工酶2（Hexokinase isoenzyme 2,HXK2）可以将果糖磷酸化果糖-6-磷酸,因此有必要将其缺陷而构建果糖低消耗宿主菌株,从而提高D-阿洛糖的产量。具体研究方法和结果如下:（1）酿酒酵母中高效CRISPR/Cas9基因... 

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第一章 绪论
    1.1 功能性稀有糖
        1.1.1 稀有糖概述
        1.1.2 Izumoring策略
        1.1.3 非Izumoring策略
    1.2 D-阿洛糖的概述
        1.2.1 D-阿洛糖物理化学特性
        1.2.2 D-阿洛糖的生理学功能
        1.2.3 D-阿洛糖的生物合成
    1.3 CRISPR/Cas9 系统的概述
        1.3.1 CRISPR/Cas系统的发现
        1.3.2 CRISPR/Cas系统的分类及作用机制
        1.3.3 CRISPR/Cas9 系统在酿酒酵母中的应用
    1.4 论文的研究意义以及主要研究内容
        1.4.1 课题研究意义
        1.4.2 主要研究内容
        1.4.3 研究技术路线
第二章 酿酒酵母中高效CRISPR/Cas9 基因编辑系统的构建
    2.1 引言
    2.2 材料与设备
        2.2.1 菌株和质粒
        2.2.2 主要仪器和设备
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 培养基与溶液
    2.3 实验方法
        2.3.1 rDNA整合型Cas9 表达质粒的构建
        2.3.2 rDNA整合型Cas9 表达菌株的构建
        2.3.3 靶向ade2 位点的gRNA表达质粒的构建
        2.3.4 靶向ade2 位点的Cas9/gRNA共表达游离型质粒的构建
        2.3.5 ade2 位点双链断裂修复donorDNA构建
        2.3.6 酿酒酵母ade2缺失菌株的构建
    2.4 结果讨论
        2.4.1 酿酒酵母rDNA整合型Cas9 表达菌株的构建
        2.4.2 donor-tll2 表达盒的构建
        2.4.3 rDNA整合型Cas9 介导的酿酒酵母ade2 基因缺失菌的构建
        2.4.4 游离型Cas9 系统介导的酿酒酵母ade2 基因缺失菌的构建
        2.4.5 不同敲除系统对ade2基因编辑效率的影响
    2.5 本章小结
第三章 基于CRISPR/Cas9 构建酿酒酵母果糖低消耗宿主菌
    3.1 引言
    3.2 材料与设备
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 仪器和设备
        3.2.3 试剂
        3.2.4 培养基与溶液
    3.3 实验方法
        3.3.1 p YES2-CG-?hxk2 敲除质粒的构建
        3.3.2 donor-hxk2 的构建
        3.3.3 酿酒酵母hxk2基因敲除菌的构建
        3.3.4 菌株BY4741-?hxk2的果糖发酵培养
        3.3.5 果糖含量的测定
        3.3.6 数据处理
    3.4 结果讨论
        3.4.1 敲除质粒p YES2-CG-?hxk2 的构建
        3.4.2 donor-hxk2 的构建
        3.4.3 酿酒酵母hxk2基因敲除菌的构建
        3.4.4 菌株BY4741-?hxk2的生长特性
        3.4.5 菌株BY4741-?hxk2对果糖利用
    3.5 本章小结
第四章 D-阿洛糖的生物合成
    4.1 引言
    4.2 材料与设备
        4.2.1 菌株和质粒
        4.2.2 主要仪器和设备
        4.2.3 主要试剂
        4.2.4 培养基与溶液
    4.3 实验方法
        4.3.1 D-阿洛酮糖/D-阿洛糖为唯一碳源培养酿酒酵母
        4.3.2 dep和 lri基因串联表达盒的构建
        4.3.3 D-阿洛糖生产菌株的构建
        4.3.4 改造菌株Y1的摇瓶发酵
        4.3.5 糖的测定
    4.4 结果讨论
        4.4.1 酿酒酵母对D-阿洛酮糖的利用
        4.4.2 酿酒酵母对D-阿洛糖的利用
        4.4.3 dep和 lri基因串联表达盒的构建
        4.4.4 D-阿洛糖生产菌株的构建
        4.4.5 酿酒酵母菌株Y1的摇瓶发酵
    4.5 本章小结
结论与展望
    结论
    展望
    本论文创新点
参考文献
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]D-阿洛酮糖的功能及其生物合成研究进展[J]. 沈雪梅,王靖,张媛,王小艳,丁子元,李义,陈博,佟毅.  生物工程学报. 2018(09)
[2]CRISPR/Cas9介导的高产谷胱甘肽原养型酵母工程菌的构建[J]. 周文龙,唐亮,成凯,刘忞之,杨燕,王伟.  生物工程学报. 2017(12)
[3]酿酒酵母rDNA的结构及其介导整合影响因素研究进展[J]. 孙恒一,臧晓南,张学成.  武汉大学学报(理学版). 2014(01)
[4]CRISPR/Cas系统:RNA靶向的基因组定向编辑新技术[J]. 李君,张毅,陈坤玲,单奇伟,王延鹏,梁振,高彩霞.  遗传. 2013(11)
[5]CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化[J]. 李铁民,杜波.  遗传. 2011(03)

博士论文
[1]D-阿洛酮糖3-差向异构酶的高效表达、酶学性质及分子改造[D]. 张文立.江南大学 2017

硕士论文
[1]马克斯克鲁维酵母D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因工程菌的构建[D]. 朱星星.合肥工业大学 2018
[2]酿酒酵母孢子固定化酶催化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的研究[D]. 李毅.江南大学 2015



本文编号：3720103