鱼源致腐菌荧光假单胞菌群体感应LuxI/LuxR鉴定及生理功能研究
发布时间：2022-12-18 06:50
荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）具有较高的蛋白质、脂质水解力,和良好的嗜冷性,是生鱼、肉类和乳制品中重要的革兰氏阴性腐败菌。群体感应是一种细胞间的交流机制,参与毒力因子分泌、生物被膜形成、食品腐败等的调控。现有研究表明希瓦氏菌、气单胞菌、假单胞菌等革兰氏阴性的致腐性与群体感应密切相关,然而,,P.fluuoescens中AHLs介导的QS系统分子信息及其调控生物被膜、腐败和抗胁迫性的机制的研究较少。鉴于此,本研究以冷藏腐败大黄鱼中分离鉴定的优势腐败菌P.fluorescensPF07为研究对象,采用生物报菌法和高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测PF07中的AHLs活性,利用基因框架测序技术预测PF07全基因组,并对获得的LuxI和LuxR蛋白进行生物信息学分析;构建并验证luxl和luxR基因缺失株,比较研究野生株和缺失株的生长、生物被膜、致腐表型及抗胁迫性差异变化,评价luxI基因缺失株中外源添加C4-HSL的影响;基于转录组学测序技术研究luxI和luxR基因缺失对P.fluorescens的基因表达及代谢通路的影响,旨在更加全面地了解致腐菌...
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 生鲜食品中的腐败菌
1.1.1 食品腐败菌类型
1.1.2 荧光假单胞菌
1.2 革兰氏阴性菌与群体感应
1.2.1 群体感应
1.2.2 自诱导物、合成酶、受体及特异性
1.2.2.1 自诱导物
1.2.2.2 AHLs合成酶
1.2.2.3 受体及特异性
1.2.3 群体感应与食品腐败
1.2.4 群体感应与细菌生物被膜形成
1.2.5 群体感应与细菌抗胁迫性
1.3 假单胞菌中的群体感应
1.3.1 铜绿假单胞菌中的群体感应
1.3.2 荧光假单胞菌中的群体感应
1.3.3 其他假单胞菌中的群体感应
1.4 本课题的研究目的、意义和内容
第二章 荧光假单胞菌PF07基因组中LuxI/LuxR生物信息学分析
2.1 前言
2.2 材料与设备
2.2.1 菌株及培养条件
2.2.2 试剂
2.2.3 主要仪器设备
2.3 试验方法
2.3.1 报告菌法和LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性
2.3.1.1 PF07生长曲线测定
2.3.1.2 报告菌法检测PF07信号分子活性
2.3.1.3 PF07信号分子提取
2.3.1.4 LC/MS-MS检测PF07信号分子
2.3.2 菌体的培养与收集
2.3.3 总DNA的提取及全基因组测序
2.3.4 文库构建与质检
2.3.5 P.fluorescens PF07基因组组分分析
2.3.6 P.fluorescens PF07基因功能注释
2.3.7 P.fluorescens PF07 Lux/LuxR基因PCR扩增
2.3.7.1 DNA提取
2.3.7.2 引物设计及PCR扩增
2.3.8 LuxI/LuxR同源性、保守位点分析及三维结构模拟
2.4 数据处理和分析
2.5 结果分析
2.5.1 报告菌法分析PF07信号分子活性
2.5.2 LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性
2.5.3 DNA文库构建与测序质量评估
2.5.3.1 测序数据概况
2.5.3.2 基因组大小预测
2.5.3.3 基因组组装分析
2.5.4 P.fluorescens PF07基因组组分分析
2.5.4.1 编码基因预测
2.5.4.2 ncRNA预测
2.5.4.3 Prophage预测
2.5.4.4 CRISPRs预测
2.5.5 P.fluorescens PF07基因功能分析
2.5.5.1 P.fluorescens PF07蛋白质COG聚类分析
2.5.5.2 P.fluorescens PF07次级代谢基因簇分析
2.5.6 PCR验证P.fluorescens PF07中LuxI与LuxR基因
2.5.7 LuxI/LuxR进化树、保守位点分析及三维结构模拟
2.6 讨论
第三章 LuxI/LuxR缺失对PF07生物被膜、致腐及抗胁迫力的影响
3.1 前言
3.2 材料与设备
3.2.1 材料、菌株及培养条件
3.2.2 试剂
3.2.3 主要仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 LuxI及LuxR缺失株的构建
3.3.2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失验证
3.3.2.1 DNA提取
3.3.2.2 引物设计及PCR扩增
3.3.3 报告菌法及LC-MS/MS检测AHLs活性
3.3.4 野生株和缺失株的生长能力比较
3.3.5 野生株和缺失株的生物被膜形成能力测定
3.3.5.1 结晶紫法测定生物被膜量
3.3.5.2 粘附能力测定
3.3.5.3 水溶性胞外多糖含量检测
3.3.5.4 CLSM及SEM观察粘附被膜
3.3.5.5 泳动能力测定
3.3.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力测定
3.3.6.1 灭菌鱼汁制备和接种
3.3.6.2 鱼汁中生长曲线测定
3.3.6.3 胞外蛋白酶活性测定
3.3.6.4 嗜铁素相对含量测定
3.3.6.5 TVB-N含量测定
3.3.7 野生株和缺失株抗胁迫力的测定
3.4 数据处理和分析
3.5 结果分析
3.5.1 △luxR和△luxI基因缺失验证
3.5.2 生物报告菌法和LC-MS/MS检测野生株和缺失株AHLs活性
3.5.3 野生株和缺失株的生长
3.5.4 野生株和缺失株生物被膜形成比较
3.5.4.1 生物被膜结晶紫定量比较
3.5.4.2 粘附能力
3.5.4.3 水溶性胞外多糖含量比较
3.5.4.4 CLSM及SEM观察被膜结构差异
3.5.4.5 泳动能力比较
3.5.5 野生株和缺失株抗胁迫力比较
3.5.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力比较
3.5.6.1 鱼汁中生长差异的比较
3.5.6.2 胞外蛋白酶活性分析
3.5.6.3 嗜铁素相对含量比较
3.5.6.4 TVB-N含量比较
3.6 讨论
第四章 基于转录组学分析LuxI/LuxR对PF07生理功能调控的机制
4.1 前言
4.2 材料与仪器
4.2.1 主要试剂和培养基
4.2.2 主要仪器
4.3 转录组学测序
4.3.1 细菌培养及样品制备
4.3.2 样品总RNA提取纯化及质量检测
4.3.3 文库构建与测序
4.3.4 质量控制与参考基因组比对分析
4.3.5 基因表达水平分析及差异基因筛选
4.3.6 差异基因筛选
4.3.7 差异表达基因的GO富集
4.3.8 差异表达基因的KEGG pathway富集
4.4 荧光定量PCR验证
4.4.1 样品总RNA提取
4.4.2 总RNA反转录
4.4.3 荧光定量PCR
4.5 数据处理和分析
4.6 结果与分析
4.6.1 转录组reads质量与统计分析
4.6.2 差异基因表达分析
4.6.3 差异基因聚类分析
4.6.4 差异表达基因GO富集分析
4.6.5 差异表达基因GO富集分析KEGG Pathway富集分析结果
4.6.6 差异表达基因分类整理
4.6.6.1 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens生物被膜相关基因的影响
4.6.6.2 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens致腐性相关基因的影响
4.6.6.3 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens抗胁迫能力相关基因的影响
4.6.9 荧光定量PCR验证
4.6.9.1 PCR产物扩增曲线及引物特异性分析
4.6.9.2 基因表达量差异
4.6.10 群体感应LuxI/LuxR调控机制模拟图
4.7 讨论
第五章 总结、创新点和展望
5.1 总结
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
致谢
附录Ⅰ 转录组学差异基因列表
附录Ⅱ 攻读硕士学位期间主要研究成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,刘明爽,马燕,励建荣. 现代食品科技. 2015(12)
[2]冷藏大黄鱼SSO希瓦氏菌致腐能力差异机制初探[J]. 赵二科,朱军莉,冯立芳,施永清,励建荣. 水产学报. 2015(02)
[3]GB T5009—2003《食品卫生检验方法》理化部分简介[J]. 王竹天,兰真,鲁杰,蒋定国. 中国食品卫生杂志. 2005(03)
[4]中华人民共和国专业标准出口干制肠衣检验方法[J]. 商品与质量. 1996(03)
博士论文
[1]食源假单胞菌群体感应信号分子的产生及其对食品腐败的影响[D]. 綦国红.南京农业大学 2006
[2]3，5-DNBA降解菌和生物膜形成菌对硝基芳香烃废水的生物强化处理研究[D]. 李蒙英.南京农业大学 2007
硕士论文
[1]大黄鱼源Shewanella baltica群体感应LuxS蛋白及cyclo-（L-Pro-L-Leu）信号分子功能研究[D]. 叶晓锋.浙江工商大学 2017
本文编号：3721571
【文章页数】：112 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 生鲜食品中的腐败菌
1.1.1 食品腐败菌类型
1.1.2 荧光假单胞菌
1.2 革兰氏阴性菌与群体感应
1.2.1 群体感应
1.2.2 自诱导物、合成酶、受体及特异性
1.2.2.1 自诱导物
1.2.2.2 AHLs合成酶
1.2.2.3 受体及特异性
1.2.3 群体感应与食品腐败
1.2.4 群体感应与细菌生物被膜形成
1.2.5 群体感应与细菌抗胁迫性
1.3 假单胞菌中的群体感应
1.3.1 铜绿假单胞菌中的群体感应
1.3.2 荧光假单胞菌中的群体感应
1.3.3 其他假单胞菌中的群体感应
1.4 本课题的研究目的、意义和内容
第二章 荧光假单胞菌PF07基因组中LuxI/LuxR生物信息学分析
2.1 前言
2.2 材料与设备
2.2.1 菌株及培养条件
2.2.2 试剂
2.2.3 主要仪器设备
2.3 试验方法
2.3.1 报告菌法和LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性
2.3.1.1 PF07生长曲线测定
2.3.1.2 报告菌法检测PF07信号分子活性
2.3.1.3 PF07信号分子提取
2.3.1.4 LC/MS-MS检测PF07信号分子
2.3.2 菌体的培养与收集
2.3.3 总DNA的提取及全基因组测序
2.3.4 文库构建与质检
2.3.5 P.fluorescens PF07基因组组分分析
2.3.6 P.fluorescens PF07基因功能注释
2.3.7 P.fluorescens PF07 Lux/LuxR基因PCR扩增
2.3.7.1 DNA提取
2.3.7.2 引物设计及PCR扩增
2.3.8 LuxI/LuxR同源性、保守位点分析及三维结构模拟
2.4 数据处理和分析
2.5 结果分析
2.5.1 报告菌法分析PF07信号分子活性
2.5.2 LC/MS-MS检测P.fluorescens PF07信号分子活性
2.5.3 DNA文库构建与测序质量评估
2.5.3.1 测序数据概况
2.5.3.2 基因组大小预测
2.5.3.3 基因组组装分析
2.5.4 P.fluorescens PF07基因组组分分析
2.5.4.1 编码基因预测
2.5.4.2 ncRNA预测
2.5.4.3 Prophage预测
2.5.4.4 CRISPRs预测
2.5.5 P.fluorescens PF07基因功能分析
2.5.5.1 P.fluorescens PF07蛋白质COG聚类分析
2.5.5.2 P.fluorescens PF07次级代谢基因簇分析
2.5.6 PCR验证P.fluorescens PF07中LuxI与LuxR基因
2.5.7 LuxI/LuxR进化树、保守位点分析及三维结构模拟
2.6 讨论
第三章 LuxI/LuxR缺失对PF07生物被膜、致腐及抗胁迫力的影响
3.1 前言
3.2 材料与设备
3.2.1 材料、菌株及培养条件
3.2.2 试剂
3.2.3 主要仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 LuxI及LuxR缺失株的构建
3.3.2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失验证
3.3.2.1 DNA提取
3.3.2.2 引物设计及PCR扩增
3.3.3 报告菌法及LC-MS/MS检测AHLs活性
3.3.4 野生株和缺失株的生长能力比较
3.3.5 野生株和缺失株的生物被膜形成能力测定
3.3.5.1 结晶紫法测定生物被膜量
3.3.5.2 粘附能力测定
3.3.5.3 水溶性胞外多糖含量检测
3.3.5.4 CLSM及SEM观察粘附被膜
3.3.5.5 泳动能力测定
3.3.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力测定
3.3.6.1 灭菌鱼汁制备和接种
3.3.6.2 鱼汁中生长曲线测定
3.3.6.3 胞外蛋白酶活性测定
3.3.6.4 嗜铁素相对含量测定
3.3.6.5 TVB-N含量测定
3.3.7 野生株和缺失株抗胁迫力的测定
3.4 数据处理和分析
3.5 结果分析
3.5.1 △luxR和△luxI基因缺失验证
3.5.2 生物报告菌法和LC-MS/MS检测野生株和缺失株AHLs活性
3.5.3 野生株和缺失株的生长
3.5.4 野生株和缺失株生物被膜形成比较
3.5.4.1 生物被膜结晶紫定量比较
3.5.4.2 粘附能力
3.5.4.3 水溶性胞外多糖含量比较
3.5.4.4 CLSM及SEM观察被膜结构差异
3.5.4.5 泳动能力比较
3.5.5 野生株和缺失株抗胁迫力比较
3.5.6 野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力比较
3.5.6.1 鱼汁中生长差异的比较
3.5.6.2 胞外蛋白酶活性分析
3.5.6.3 嗜铁素相对含量比较
3.5.6.4 TVB-N含量比较
3.6 讨论
第四章 基于转录组学分析LuxI/LuxR对PF07生理功能调控的机制
4.1 前言
4.2 材料与仪器
4.2.1 主要试剂和培养基
4.2.2 主要仪器
4.3 转录组学测序
4.3.1 细菌培养及样品制备
4.3.2 样品总RNA提取纯化及质量检测
4.3.3 文库构建与测序
4.3.4 质量控制与参考基因组比对分析
4.3.5 基因表达水平分析及差异基因筛选
4.3.6 差异基因筛选
4.3.7 差异表达基因的GO富集
4.3.8 差异表达基因的KEGG pathway富集
4.4 荧光定量PCR验证
4.4.1 样品总RNA提取
4.4.2 总RNA反转录
4.4.3 荧光定量PCR
4.5 数据处理和分析
4.6 结果与分析
4.6.1 转录组reads质量与统计分析
4.6.2 差异基因表达分析
4.6.3 差异基因聚类分析
4.6.4 差异表达基因GO富集分析
4.6.5 差异表达基因GO富集分析KEGG Pathway富集分析结果
4.6.6 差异表达基因分类整理
4.6.6.1 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens生物被膜相关基因的影响
4.6.6.2 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens致腐性相关基因的影响
4.6.6.3 LuxI/LuxR敲除对P.fluorscens抗胁迫能力相关基因的影响
4.6.9 荧光定量PCR验证
4.6.9.1 PCR产物扩增曲线及引物特异性分析
4.6.9.2 基因表达量差异
4.6.10 群体感应LuxI/LuxR调控机制模拟图
4.7 讨论
第五章 总结、创新点和展望
5.1 总结
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
致谢
附录Ⅰ 转录组学差异基因列表
附录Ⅱ 攻读硕士学位期间主要研究成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]大菱鲆荧光假单胞菌的群体感应现象及不同碳源培养下的腐败特性研究[J]. 崔方超,李婷婷,刘明爽,马燕,励建荣. 现代食品科技. 2015(12)
[2]冷藏大黄鱼SSO希瓦氏菌致腐能力差异机制初探[J]. 赵二科,朱军莉,冯立芳,施永清,励建荣. 水产学报. 2015(02)
[3]GB T5009—2003《食品卫生检验方法》理化部分简介[J]. 王竹天,兰真,鲁杰,蒋定国. 中国食品卫生杂志. 2005(03)
[4]中华人民共和国专业标准出口干制肠衣检验方法[J]. 商品与质量. 1996(03)
博士论文
[1]食源假单胞菌群体感应信号分子的产生及其对食品腐败的影响[D]. 綦国红.南京农业大学 2006
[2]3，5-DNBA降解菌和生物膜形成菌对硝基芳香烃废水的生物强化处理研究[D]. 李蒙英.南京农业大学 2007
硕士论文
[1]大黄鱼源Shewanella baltica群体感应LuxS蛋白及cyclo-（L-Pro-L-Leu）信号分子功能研究[D]. 叶晓锋.浙江工商大学 2017
本文编号：3721571
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3721571.html
