酿酒酵母Mek1与Hop1复合物及海环杆菌去乙酰化酶CmCBDA的结构与功能研究
发布时间：2023-01-03 11:36
论文的第一部分阐述了酿酒酵母减数分裂过程中,联会复合体的侧向元件Hopl与Mekl相互作用的结构与功能研究。减数分裂是一种特殊的细胞分裂方式,是有性生殖不可缺少的环节。减数分裂的正常进行对于维持物种染色体数目的稳定及产生多样性的后代十分重要。减数分裂前期Ⅰ过程中的同源重组是实现来自父本和母本基因信息交换的重要过程。同源重组的顺利进行需要联会复合体的参与以实现其一系列生物学行为的精确调控。联会复合体的结构组分Hopl通过其SCD结构域318位苏氨酸磷酸化与减数分裂特异性激酶Mekl FHA结构域的相互作用来实现后者的定位与激活。激活的Mekl磷酸化一系列底物使得同源重组过程中修复模板的选择倾向于同源染色体的非姐妹染色单体,从而实现减数分裂的同源重组及后续行为的正常进行。认知Mekl-FHA如何识别Hopl pT318对于深入理解Mekl的定位与激活十分重要。本文展示了酿酒酵母Mekl-FHA的单体及与Hopl pT318小肽复合物的晶体结构。通过分析Mekl-FHA和PDB中已有的FHA结构域,我们提出一类位于结合口袋处的PSXS Motif。此类Motif在三维结构和底物识别模式上具有...
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 酿酒酵母Mek1与Hop1相互作用的结构与功能研究
1.1 背景介绍
1.1.1 引言
1.1.2 减数分裂前期Ⅰ的染色体行为
1.1.3 同源染色体间的配对、联会和重组
1.1.4 联会复合体
1.1.5 线性元件
1.1.6 联会复合体侧向元件Hop1的组装与功能
1.1.7 减数分裂特异性激酶Mek1
1.1.8 FHA结构域的结构特点
1.1.9 FHA结构域的底物识别特点
1.1.10 FHA结构域介导的磷酸化非依赖性的相互作用
1.1.11 总结
1.2 实验材料与方法
1.2.1 酿酒酵母及裂殖酵母Mek1 FHA结构域的基因获取
1.2.2 目的基因片段回收
1.2.3 目的基因片段的双酶切实验
1.2.4 质粒的改造提取及线性化
1.2.5 重组质粒的构建
1.2.6 感受态细胞的制备
1.2.7 连接产物转化至感受态细胞
1.2.8 单克隆的鉴定与测序
1.2.9 突变体的构建
1.2.10 Mek1 FHA结构域的表达
1.2.11 6×His标签融合蛋白质的纯化
1.2.12 GST标签蛋白质的亲和纯化
1.2.13 重组蛋白质的TEV酶切
1.2.14 蛋白质的精细纯化-AKTA系统分子筛
1.2.15 蛋白质的精细纯化-AKTA系统离子交换
1.2.16 SDS-PAGE蛋白质电泳
1.2.17 等温滴定量热实验
1.2.18 蛋白质晶体的生长、数据收集及结构解析
1.2.19 蛋白质的圆二色光谱
1.3 实验结果
1.3.1 酿酒酵母和裂殖酵母Mek1 FHA结构域的重组表达
1.3.2 体外鉴定酿酒酵母Mek1-FHA对Hop1 pThr318的优先选择性
1.3.3 酿酒酵母Mek1-FHA单体及与Hop1 pThr318复合物晶体结构
1.3.4 酿酒酵母Mek1-FHA与Hop1 pThr318的相互作用细节
1.3.5 Mek1-FHA对Hop1 pThr318的pT+2和pT+3的特异性相互作用
1.3.6 Mek1-FHA的结构特点及其PSXS Motif
1.3.7 酿酒酵母Mek1-FHA结合底物的鉴定
1.3.8 裂殖酵母Mek1-FHA结合底物的鉴定
1.4 讨论
1.4.1 酿酒酵母Mek1 FHA结构域结合底物的特异性
1.4.2 FHA结构域介导的非传统的相互作用
1.4.3 酿酒酵母和裂殖酵母Mek1激酶活性的调控机制
1.5 课题总结与展望
1.5.1 酿酒酵母Hop1 SCD上多磷酸化位点与Mek1-FHA的相互作用
1.5.2 酿酒酵母Mek1激酶激活机制的研究
1.5.3 裂殖酵母Mek1 pThr15和Hop1 pThr270功能探索
第2章 海环杆菌去乙酰化酶CmCBDA结构与功能的研究
2.1 背景介绍
2.1.1 骨关节炎的特点及其预防与治疗
2.1.2 葡萄糖胺在骨关节炎预防与治疗中的作用
2.1.3 葡萄糖胺的需求与生产工艺探索
2.1.4 葡萄糖胺的工业化生产流程
2.1.5 CmCBDA的鉴定和酶活特点
2.1.6 Ydjc家族的研究进展
2.1.7 总结
2.2 实验材料与方法
2.2.1 目的基因的合成与优化
2.2.2 CmCBDA的克隆表达与纯化
2.2.3 晶体的初步筛选
2.2.4 衍射数据的收集和处理
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 CmCBDA的全长表达
2.3.2 CmCBDA的晶体结构描述
2.3.3 酶活口袋的细节描述
2.3.4 Ydjc家族成员的序列比对结果
2.3.5 CmCBDA的同源性搜索
2.3.6 CmCBDA对乙酰葡萄糖胺选择性识别的初步阐述
2.4 总结与展望
参考文献
附录1
附录2
致谢
在读期间发表的学术论文与参加的学术会议
本文编号：3727398
【文章页数】：114 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 酿酒酵母Mek1与Hop1相互作用的结构与功能研究
1.1 背景介绍
1.1.1 引言
1.1.2 减数分裂前期Ⅰ的染色体行为
1.1.3 同源染色体间的配对、联会和重组
1.1.4 联会复合体
1.1.5 线性元件
1.1.6 联会复合体侧向元件Hop1的组装与功能
1.1.7 减数分裂特异性激酶Mek1
1.1.8 FHA结构域的结构特点
1.1.9 FHA结构域的底物识别特点
1.1.10 FHA结构域介导的磷酸化非依赖性的相互作用
1.1.11 总结
1.2 实验材料与方法
1.2.1 酿酒酵母及裂殖酵母Mek1 FHA结构域的基因获取
1.2.2 目的基因片段回收
1.2.3 目的基因片段的双酶切实验
1.2.4 质粒的改造提取及线性化
1.2.5 重组质粒的构建
1.2.6 感受态细胞的制备
1.2.7 连接产物转化至感受态细胞
1.2.8 单克隆的鉴定与测序
1.2.9 突变体的构建
1.2.10 Mek1 FHA结构域的表达
1.2.11 6×His标签融合蛋白质的纯化
1.2.12 GST标签蛋白质的亲和纯化
1.2.13 重组蛋白质的TEV酶切
1.2.14 蛋白质的精细纯化-AKTA系统分子筛
1.2.15 蛋白质的精细纯化-AKTA系统离子交换
1.2.16 SDS-PAGE蛋白质电泳
1.2.17 等温滴定量热实验
1.2.18 蛋白质晶体的生长、数据收集及结构解析
1.2.19 蛋白质的圆二色光谱
1.3 实验结果
1.3.1 酿酒酵母和裂殖酵母Mek1 FHA结构域的重组表达
1.3.2 体外鉴定酿酒酵母Mek1-FHA对Hop1 pThr318的优先选择性
1.3.3 酿酒酵母Mek1-FHA单体及与Hop1 pThr318复合物晶体结构
1.3.4 酿酒酵母Mek1-FHA与Hop1 pThr318的相互作用细节
1.3.5 Mek1-FHA对Hop1 pThr318的pT+2和pT+3的特异性相互作用
1.3.6 Mek1-FHA的结构特点及其PSXS Motif
1.3.7 酿酒酵母Mek1-FHA结合底物的鉴定
1.3.8 裂殖酵母Mek1-FHA结合底物的鉴定
1.4 讨论
1.4.1 酿酒酵母Mek1 FHA结构域结合底物的特异性
1.4.2 FHA结构域介导的非传统的相互作用
1.4.3 酿酒酵母和裂殖酵母Mek1激酶活性的调控机制
1.5 课题总结与展望
1.5.1 酿酒酵母Hop1 SCD上多磷酸化位点与Mek1-FHA的相互作用
1.5.2 酿酒酵母Mek1激酶激活机制的研究
1.5.3 裂殖酵母Mek1 pThr15和Hop1 pThr270功能探索
第2章 海环杆菌去乙酰化酶CmCBDA结构与功能的研究
2.1 背景介绍
2.1.1 骨关节炎的特点及其预防与治疗
2.1.2 葡萄糖胺在骨关节炎预防与治疗中的作用
2.1.3 葡萄糖胺的需求与生产工艺探索
2.1.4 葡萄糖胺的工业化生产流程
2.1.5 CmCBDA的鉴定和酶活特点
2.1.6 Ydjc家族的研究进展
2.1.7 总结
2.2 实验材料与方法
2.2.1 目的基因的合成与优化
2.2.2 CmCBDA的克隆表达与纯化
2.2.3 晶体的初步筛选
2.2.4 衍射数据的收集和处理
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 CmCBDA的全长表达
2.3.2 CmCBDA的晶体结构描述
2.3.3 酶活口袋的细节描述
2.3.4 Ydjc家族成员的序列比对结果
2.3.5 CmCBDA的同源性搜索
2.3.6 CmCBDA对乙酰葡萄糖胺选择性识别的初步阐述
2.4 总结与展望
参考文献
附录1
附录2
致谢
在读期间发表的学术论文与参加的学术会议
本文编号：3727398
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3727398.html
