基于非洲猪瘟病毒p72蛋白纳米抗体的竞争ELISA检测方法的建立
发布时间：2023-04-20 22:39
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种接触传染、高致死率的猪传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病,病死率高达100%,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2018年ASF传入我国,由于缺乏有效疫苗,已给我国养猪业造成无法估量的经济损失,严重影响了我国整个生猪产业链。该病的病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),ASFV为大型双链DNA病毒,其全基因组在170-193 kb之间,不同毒株约包含151-167个基因不等。纳米抗体(Nanobody,Nb)是存在于骆驼科动物体内,天然缺失轻链和重链第一恒定区的一种单链抗体。该抗体具有分子量小,稳定性高,易于基因改造的优点,近年来已被广泛应用于人和动物疫病的诊断和治疗中。然而,关于纳米抗体在ASFV诊断和防治中的应用却一直未见相关研究报道。本研究利用原核表达ASFV-p72蛋白免疫双峰驼,构建噬菌体文库,通过噬菌体展示技术筛选获得了针对p72蛋白的纳米抗体。随后,将筛选的纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行融合表达,并利用该融合蛋白建立了一种快速检测猪血清...
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 非洲猪瘟的研究进展
1.1.1 非洲猪瘟概述
1.1.2 非洲猪瘟病毒特点
1.1.3 非洲猪瘟病毒编码的主要蛋白特点
1.1.4 非洲猪瘟的传播途径和临床症状
1.1.5 非洲猪瘟的诊断
1.1.6 非洲猪瘟疫苗
1.2 纳米抗体研究进展
1.2.1 纳米抗体的结构特征
1.2.2 纳米抗体的特性
1.2.3 纳米抗体的应用
1.3 研究目的及意义
第二章 非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达与纯化
2.1 材料
2.1.1 仪器设备
2.1.2 试剂耗材
2.2 方法
2.2.1 ASFV-p72基因的扩增
2.2.2 ASFV-p72重组蛋白的表达纯化
2.3 结果
2.3.1 原核表达载体p ET-28a-ASFV-p72 的构建
2.3.2 ASFV-p72 重组蛋白的表达及抗原性分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 非洲猪瘟病毒p72蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选
3.1 材料
3.1.1 仪器设备
3.1.2 试剂耗材
3.1.3 载体和试验动物
3.2 方法
3.2.1 免疫双峰驼
3.2.2 纳米抗体文库的构建
3.2.3 p72蛋白特异性纳米抗体的淘选
3.2.4 p72蛋白特异性纳米抗体的鉴定
3.3 结果
3.3.1 抗p72蛋白抗体滴度测定
3.3.2 纳米抗体文库的构建及阳性率的检测
3.3.3 p72重组蛋白特异性纳米抗体的淘选
3.3.4 p72蛋白特异性纳米抗体的鉴定
3.3.5 p72蛋白特异性纳米抗体结合抗原能力分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 基于纳米抗体-HRP融合蛋白建立猪血清中ASFV抗体竞争ELISA检测方法
4.1 材料
4.1.1 仪器设备
4.1.2 试剂耗材
4.2 方法
4.2.1 pEGFP-N1-ASFV-Nb4 真核表达载体的构建
4.2.2 真核表达ASFV-p72-Nb4 蛋白
4.2.3 验证p72蛋白与p72-Nb4的亲和力
4.2.4 基于纳米抗体的竞争ELISA方法的建立
4.3 结果
4.3.1 p EGFP-ASFV-p72-Nb4 真核表达载体的构建
4.3.2 p72-Nb4的表达以及与p72蛋白亲和力的鉴定
4.3.3 竞争ELISA最佳条件的确定
4.3.4 竞争ELISA方法Cut-off值的确定
4.3.5 敏感性评价
4.3.6 特异性评价
4.3.7 符合率评价
4.4 讨论
4.5 小结
结论
参考文献
合作研究协议
关于同意使用生物安全三级实验室的承诺
致谢
个人简历
本文编号：3795296
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 非洲猪瘟的研究进展
1.1.1 非洲猪瘟概述
1.1.2 非洲猪瘟病毒特点
1.1.3 非洲猪瘟病毒编码的主要蛋白特点
1.1.4 非洲猪瘟的传播途径和临床症状
1.1.5 非洲猪瘟的诊断
1.1.6 非洲猪瘟疫苗
1.2 纳米抗体研究进展
1.2.1 纳米抗体的结构特征
1.2.2 纳米抗体的特性
1.2.3 纳米抗体的应用
1.3 研究目的及意义
第二章 非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达与纯化
2.1 材料
2.1.1 仪器设备
2.1.2 试剂耗材
2.2 方法
2.2.1 ASFV-p72基因的扩增
2.2.2 ASFV-p72重组蛋白的表达纯化
2.3 结果
2.3.1 原核表达载体p ET-28a-ASFV-p72 的构建
2.3.2 ASFV-p72 重组蛋白的表达及抗原性分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 非洲猪瘟病毒p72蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选
3.1 材料
3.1.1 仪器设备
3.1.2 试剂耗材
3.1.3 载体和试验动物
3.2 方法
3.2.1 免疫双峰驼
3.2.2 纳米抗体文库的构建
3.2.3 p72蛋白特异性纳米抗体的淘选
3.2.4 p72蛋白特异性纳米抗体的鉴定
3.3 结果
3.3.1 抗p72蛋白抗体滴度测定
3.3.2 纳米抗体文库的构建及阳性率的检测
3.3.3 p72重组蛋白特异性纳米抗体的淘选
3.3.4 p72蛋白特异性纳米抗体的鉴定
3.3.5 p72蛋白特异性纳米抗体结合抗原能力分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 基于纳米抗体-HRP融合蛋白建立猪血清中ASFV抗体竞争ELISA检测方法
4.1 材料
4.1.1 仪器设备
4.1.2 试剂耗材
4.2 方法
4.2.1 pEGFP-N1-ASFV-Nb4 真核表达载体的构建
4.2.2 真核表达ASFV-p72-Nb4 蛋白
4.2.3 验证p72蛋白与p72-Nb4的亲和力
4.2.4 基于纳米抗体的竞争ELISA方法的建立
4.3 结果
4.3.1 p EGFP-ASFV-p72-Nb4 真核表达载体的构建
4.3.2 p72-Nb4的表达以及与p72蛋白亲和力的鉴定
4.3.3 竞争ELISA最佳条件的确定
4.3.4 竞争ELISA方法Cut-off值的确定
4.3.5 敏感性评价
4.3.6 特异性评价
4.3.7 符合率评价
4.4 讨论
4.5 小结
结论
参考文献
合作研究协议
关于同意使用生物安全三级实验室的承诺
致谢
个人简历
本文编号：3795296
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3795296.html
