嗜热毛壳菌蛋白表达系统构建及多糖单加氧酶性质研究
发布时间：2020-12-02 12:35
丝状真菌对蛋白质表达和修饰具有其他微生物不可比拟的优势,被广泛的应用于工业酶的生产当中。随着现代生物技术和高通量测序的发展,关于丝状真菌表达重组蛋白的研究也越来越多。然而单一的菌种不能满足于各种不同工业酶生产的需求,因此,越来越多的丝状真菌已经加入到表达宿主菌的行列中。嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）是一种腐生真菌,它的分布范围很广,能够在45°C50°C范围内正常生长繁殖,具有生产多种耐热型纤维素水解酶的能力,是潜在的工业纤维素生产菌株。与中温真菌相比,嗜热真菌产生的纤维素酶具有高活力和热稳定性,并且种类更为丰富。多糖单加氧酶（polysaccharide monooxygenases,PMOs）是近年来新发现的一类纤维素降解酶,因其氧化降解纤维素的独特机制而备受人们的关注。本研究依托于嗜热毛壳菌良好的基因组学和蛋白质组学研究资源,从载体的改造和蛋白的诱导表达方面开展研究,以嗜热毛壳菌中AA9（Auxiliary Activity 9,AA9）家族多糖单加氧酶PMO1为对象,首次利用嗜热毛壳菌蛋白表达系统成功表达了该酶,并对该酶的氧化...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pNK54载体的质粒图谱以及克隆位点Fig.2.1MapandmultiplecloningsitesofcarrierpNK-54
山东农业大学硕士学位论文253结果与分析3.1PMO1基因的序列分析和克隆嗜热毛壳菌Chath2p7_007187基因，即PMO1编码含有247个氨基酸的蛋白，首先对嗜热毛壳菌PMO1全长核苷酸编码的氨基酸进行序列分析，分析结果显示，PMO1酶含有一个有信号肽，表明它是胞外分泌蛋白（图3.1）。由于多糖单加氧酶信号肽后第一位氨基酸为活性中心，需要保证其信号肽第一位氨基酸充分暴露出来，所以保留其自身信号肽，确保信号肽的正确切割。以嗜热毛壳菌DNA为模板，设计引物时保留其自身信号肽和内含子，从中扩增目的基因（图3.2），保证表达出的蛋白最接近天然的状态。用DNAMAN软件分析蛋白质的序列，理论分子量的大小为26KD。信号肽预测网站Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。图3.1嗜热毛壳菌PMO1信号肽分析图谱Fig.3.1SignalpeptideanalysisofPMO1inChaetomiumthermophilus图3.2嗜热毛壳菌PMO1完整序列Figure3.2CompletesequenceofChaetomiumthermophilusPMO1
山东农业大学硕士学位论文253结果与分析3.1PMO1基因的序列分析和克隆嗜热毛壳菌Chath2p7_007187基因，即PMO1编码含有247个氨基酸的蛋白，首先对嗜热毛壳菌PMO1全长核苷酸编码的氨基酸进行序列分析，分析结果显示，PMO1酶含有一个有信号肽，表明它是胞外分泌蛋白（图3.1）。由于多糖单加氧酶信号肽后第一位氨基酸为活性中心，需要保证其信号肽第一位氨基酸充分暴露出来，所以保留其自身信号肽，确保信号肽的正确切割。以嗜热毛壳菌DNA为模板，设计引物时保留其自身信号肽和内含子，从中扩增目的基因（图3.2），保证表达出的蛋白最接近天然的状态。用DNAMAN软件分析蛋白质的序列，理论分子量的大小为26KD。信号肽预测网站Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。图3.1嗜热毛壳菌PMO1信号肽分析图谱Fig.3.1SignalpeptideanalysisofPMO1inChaetomiumthermophilus图3.2嗜热毛壳菌PMO1完整序列Figure3.2CompletesequenceofChaetomiumthermophilusPMO1
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用黑曲霉高效表达外源蛋白策略[J]. 段成宝,刘钢. 菌物研究. 2019(03)
[2]丝状真菌启动子的基因工程改造进展[J]. 孙先花,苏小运. 广西科学. 2017(01)
[3]丝状真菌高效表达异源蛋白的研究进展[J]. 刘瑞. 生物技术世界. 2015(06)
[4]丝状真菌启动子研究进展[J]. 林涛,黄建忠. 安徽农业科学. 2013(07)
[5]Construction and Secretory Expression of β-Galactosidase Gene from Lactobacillus Bulgaricus in Lactococcus Lactis[J]. ZHANG Wen1,3,WANG Chuan2,#,HUANG Cheng Yu1,#,YU Qian2,LIU Heng Chuan2,ZHANG Chao Wu2,and PEI Xiao Fang2 1.Department of Nutrition and Food Hygiene,West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;2.Department of Medical Technology,West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;3.Central Hospital of Sichuan Petroleum Bureau,Chengdu 610213,Sichuan,China. Biomedical and Environmental Sciences. 2012(02)
[6]工业酶蛋白研究的重要进展[J]. 林章凛,陈博. 生物产业技术. 2010(04)
[7]丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展[J]. 刘德辉,黄毓茂,徐蕙. 中国生物制品学杂志. 2010(02)
[8]提高蛋白质在米曲霉中表达量的策略[J]. 张建军,蔡容华,李强,施碧红. 中国生物工程杂志. 2009(01)
[9]嗜热真菌的生物转化功能与经济价值[J]. 连宾,刘丛强. 地球与环境. 2004(02)
硕士论文
[1]嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的性质及协同作用研究[D]. 王美霞.山东农业大学 2019
[2]太瑞斯梭孢壳霉糖代谢酶基因表达研究及组成型表达系统的构建[D]. 余培铠.深圳大学 2015
本文编号：2895319
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pNK54载体的质粒图谱以及克隆位点Fig.2.1MapandmultiplecloningsitesofcarrierpNK-54
山东农业大学硕士学位论文253结果与分析3.1PMO1基因的序列分析和克隆嗜热毛壳菌Chath2p7_007187基因，即PMO1编码含有247个氨基酸的蛋白，首先对嗜热毛壳菌PMO1全长核苷酸编码的氨基酸进行序列分析，分析结果显示，PMO1酶含有一个有信号肽，表明它是胞外分泌蛋白（图3.1）。由于多糖单加氧酶信号肽后第一位氨基酸为活性中心，需要保证其信号肽第一位氨基酸充分暴露出来，所以保留其自身信号肽，确保信号肽的正确切割。以嗜热毛壳菌DNA为模板，设计引物时保留其自身信号肽和内含子，从中扩增目的基因（图3.2），保证表达出的蛋白最接近天然的状态。用DNAMAN软件分析蛋白质的序列，理论分子量的大小为26KD。信号肽预测网站Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。图3.1嗜热毛壳菌PMO1信号肽分析图谱Fig.3.1SignalpeptideanalysisofPMO1inChaetomiumthermophilus图3.2嗜热毛壳菌PMO1完整序列Figure3.2CompletesequenceofChaetomiumthermophilusPMO1
山东农业大学硕士学位论文253结果与分析3.1PMO1基因的序列分析和克隆嗜热毛壳菌Chath2p7_007187基因，即PMO1编码含有247个氨基酸的蛋白，首先对嗜热毛壳菌PMO1全长核苷酸编码的氨基酸进行序列分析，分析结果显示，PMO1酶含有一个有信号肽，表明它是胞外分泌蛋白（图3.1）。由于多糖单加氧酶信号肽后第一位氨基酸为活性中心，需要保证其信号肽第一位氨基酸充分暴露出来，所以保留其自身信号肽，确保信号肽的正确切割。以嗜热毛壳菌DNA为模板，设计引物时保留其自身信号肽和内含子，从中扩增目的基因（图3.2），保证表达出的蛋白最接近天然的状态。用DNAMAN软件分析蛋白质的序列，理论分子量的大小为26KD。信号肽预测网站Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。图3.1嗜热毛壳菌PMO1信号肽分析图谱Fig.3.1SignalpeptideanalysisofPMO1inChaetomiumthermophilus图3.2嗜热毛壳菌PMO1完整序列Figure3.2CompletesequenceofChaetomiumthermophilusPMO1
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用黑曲霉高效表达外源蛋白策略[J]. 段成宝,刘钢. 菌物研究. 2019(03)
[2]丝状真菌启动子的基因工程改造进展[J]. 孙先花,苏小运. 广西科学. 2017(01)
[3]丝状真菌高效表达异源蛋白的研究进展[J]. 刘瑞. 生物技术世界. 2015(06)
[4]丝状真菌启动子研究进展[J]. 林涛,黄建忠. 安徽农业科学. 2013(07)
[5]Construction and Secretory Expression of β-Galactosidase Gene from Lactobacillus Bulgaricus in Lactococcus Lactis[J]. ZHANG Wen1,3,WANG Chuan2,#,HUANG Cheng Yu1,#,YU Qian2,LIU Heng Chuan2,ZHANG Chao Wu2,and PEI Xiao Fang2 1.Department of Nutrition and Food Hygiene,West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;2.Department of Medical Technology,West China School of Public Health,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;3.Central Hospital of Sichuan Petroleum Bureau,Chengdu 610213,Sichuan,China. Biomedical and Environmental Sciences. 2012(02)
[6]工业酶蛋白研究的重要进展[J]. 林章凛,陈博. 生物产业技术. 2010(04)
[7]丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展[J]. 刘德辉,黄毓茂,徐蕙. 中国生物制品学杂志. 2010(02)
[8]提高蛋白质在米曲霉中表达量的策略[J]. 张建军,蔡容华,李强,施碧红. 中国生物工程杂志. 2009(01)
[9]嗜热真菌的生物转化功能与经济价值[J]. 连宾,刘丛强. 地球与环境. 2004(02)
硕士论文
[1]嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的性质及协同作用研究[D]. 王美霞.山东农业大学 2019
[2]太瑞斯梭孢壳霉糖代谢酶基因表达研究及组成型表达系统的构建[D]. 余培铠.深圳大学 2015
本文编号：2895319
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